INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA INDUSTRIAL 1
Reproducibilidad y repetibilidad en el recuento de microorganismos
mesófilos totales como una base para el cálculo de incertidumbre

Pozo, L.(i)-Mucchiut, M. (i); Olmedo, M.(i); Cattapan, R.(i); Ziolo, J.(i); Peralta Apeseche,J.(i); Alvarez, M.(i)

(i)INTI-Cereales y Oleaginosas

Introducción

Históricamente el criterio para la
evaluación de los resultados de recuento de
microorganismo totales ha estado sujeto a
apreciaciones de la persona que lo evalua, siendo
muy común que haya discrepancias entre los
criterios de equivalencia entre dos resultados
similares.
Una serie de problemas que habitualmente
se presenta en los ensayos microbiológicos al
querer aplicar conceptos estadísticos es la falta de
conocimiento del valor verdadero del recuento de
microorganismos y de la distribución no
homogénea de estos en la muestra.
Dado que no existen valores de referencia
internacionales sobre la reproducibilidad (R) y la
repetibilidad (r) para recuento en placa en
matrices vegetales , el presente trabajo intenta
establecer estos valores para ser utilizados por el
laboratorio como referencia interna en los
métodos FDA-BAM (ME 302)[2] y por 3M Petrifilm
(ME 303)[1]. Estos valores podrán utilizarse como
base para el cálculo de la incertidumbre de los
resultados obtenidos.

0,00E+00
5,00E+03
1,00E+04
1,50E+04
2,00E+04
2,50E+04
3,00E+04
3,50E+04
P F 303 PF 302 Fid 303 Fid 302 Gra 303 Gra 302 Yer 303 Yer 302
Gráf. 1: Recuento de microorganismos en las diferentes matrices
para un mismo inóculo: 1,9 104 UFC/g.
A través del establecimiento de los parámetros
de R y r para un conjunto matrices en cada uno
de los métodos ME 302 y ME 303, se podrá
estimar la incertidumbre de los resultados.
El cálculo de la incertidumbre propuesto abarca
las desviaciones debidas a la matriz y los
operadores.
Metodología / Descripción Experimental

Se utilizaron cinco matrices alimentarias de origen
vegetal, que abarcan la mayoría de las muestras
analizadas comúnmente por el Laboratorio de
Microbiología del INTI-Cereales y Oleaginosas:
granas para torta (Gra), mayonesa (May), yerba
mate (Yer), fideos secos (Fid) y papas prefritas
supercongeladas (P F).
Se prepararon las muestras en tres frascos
por alimento conteniendo cada uno 10,0 ± 1,0 g
del producto . Las muestras fueron esterilizadas
en autoclave a 121ºC durante 40 minutos para
asegurar la ausencia de microorganismos viables.
Al momento de desarrollarse el análisis
cada muestra se inoculó con tres niveles de
inóculo de diferentes concentraciones de S. aureus
ATCC 25923. Se utilizaron concentraciones de
inóculo tal que por ejemplo para la muestra
denominada Gra el frasco 1 tenga una
concentración final de 103,frasc 2: 104 y frasco 3
:105 UFC/g (Unidades Formadoras de Colonias).
Desarrollo de los métodos :
a) Cálculo de r: cada una de las muestra fue
analizada por un único operador en los dos
ensayos y para cada una de las diluciones se
utilizó cinco placas (ver ecuación 1).
b) Cálculo de R: en esta ocasión cada muestra
fue realizada por dos operadores diferentes y el
recuento para cada dilución se realizó en una
placa (ver ecuación 2).
En las ecuaciones (1) y (2) se muestra
cómo se realizó el cálculo de r y R
respectivamente.

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(1)

ni = número de replicados para la matríz i.
CVi = Coeficiente de variación calculado para la matriz i.




ni = número de replicados por ME i o por el operador i.
CVi = Coeficiente de variación calculado para el ME i o por el operador i.



Resultados
En la tabla 1 y 2 se muestra la media de
recuento de microorganismos para cada matriz;
expresado como un rango de valores ( x ± t S,
siendo t el factor de Student y S la desviación
estandar ).
En el gráfico 1 se muestra, a modo de
ejemplo, la media del recuento para un valor 104
UFC/g con su respectiva desviación Las
desviaciones estandar observadas para el ME 302
son, en general, menores a las observadas para el
ME 303, la excepción es la matriz "Gra" en donde
ocurre lo contrario.

P F 303 Fid 303 Gra 303 Yer 303 May 303 Matriz
nivel
de inóculo X 103 (UFC/g)
103 1.80±0.6 1.93±0.3 1.85±0.4 1.72±0.2 1.11±0.2
104 22.5±6.5 24.6±7.7 20.6±2.8 20.4±3.8 13.2±2.3
105 327±73 399±58 338±48 292±29 190±21
Tabla 1. Promedio del recuento de microorganismos por el
ME303 ± t desv. St.

PF 302 Fid 302 Gra 302 Yer 302 May 302 Matriz
Nivel
de inóculo X 103 (UFC/g)
103 1,79 ± 0,3 2,02 ± 0,3 1,64 ± 0,2 0,02 ± 0,1(a) 1,14 ± 0,2
104 20,6 ± 6,47 21,6 ± 4,65 21,7 ± 7,74 19,9 ± 2,05 12,9 ± 2,59
105 319 ± 73,4 394 ± 88,9 345 ± 63,8 294 ± 43,3 189 ± 53,4
Tabla 2: Promedio del recuento de microorganismos por el
ME302 ± t desv. St.
(a)Hay un efecto de crecimiento negativo en la matriz "yerba"
para el ME302.

Conclusiones
Comparando los porcentajes de
desviación estándar promedio (Prom DS %) para
cada nivel de inóculo y los Prom DS % para cada
matriz, observamos que estos valores se
mantienen entre 6-7 % sin ser afectados por el
nivel de inóculo. Sin embargo, la presencia de
hidratos de carbono en la matriz afecta a este
valor. Esto queda demostrado en la matriz Yer
que, al no tener hidrato de carbono, presenta
una menor Prom DS % comparada con el resto
de las matrices.

Recuento
(UFC/g) Prom DS %
Matriz Prom DS %
103 6 PF 7
104 7 Fid 7
105 6 Gra 7

Yer 4

May 7
Tabla 3a Tabla 3b

Tabla 3a: Prom DS %promedio de todas las matricespara cada
nivel de microorganismos
Tabla 3b: Prom DS %promedio de todos los niveles de
microorganismos para cada matriz

ME303 ME302 Nivel de
inóculo Prom. U Prom. U
103 1,7 103 0,4 103 1,3 103 0,2 103
104 2,0 104 0,5 104 1,9 104 0,4 104
105 3,1 105 0,4 105 3,1 105 0,3 105
Tabla 4: Resultados de r y R de acuerdo a los diferentes
niveles de contaminación
La incertidumbre calculada(Ver tabla 4) a
partir de r y R en la ecuación (3) será utilizada
para la expresión de los resultados cuando así
sea solicitado.
Por último, a través de ensayos
intralaboratorios futuros y teniendo como
referencia estos primeros valores, se podrá
evaluar el mejoramiento del desempeño del
laboratorio en estos métodos.

Referencias
[1] ME 303 (Basado en técnicas recomendadas por FDA-BAM
Online Enero 2001 Capítulo 3; AOAC 1995 Rev. Marzo 1998
Official Methods 990.12 , Nota 3M, Instructivos y Guías de
Interpretación de 3M Petrifilm TM).
[2] ME 302 (FDA-BAM Online Enero 2001).
[3] Seppo I. Niemelä, "Uncertainty of quantitative
Determinations Deribed by Cultivation of Microorganisms"
Advisory Commission for Metrology-Publication 2002/Finland.
[4] Kornblit F., Puglisi C., "Evaluación de la Incertidumbre y
Calidad de las Mediciones" INPPAZ-2004/Argentina, Bs. As.

Bioq. Larisa Pozo –
larapozo@inti.gov.ar

(2)
(3)
[(n1-1) x CV12 + (nn-1) x CVn2
[(nn1-1) + (nn-1)
r =
[(n1-1) x CV12 + (nn-1) x CVn2
[(nn1-1) + (nn-1)
R =
(r) 2 + (R)2

n
U=