EXPRESIÓN DE QUIMOSINA DE CAMELLO RECOMBINANTE.

M. B. Pirolai, Y. Nosedai, M. M. Adjadii, R. Zandomeniiii, A. Amadioii

iInstituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI) Lácteos Rafaela.
iiInstituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) EEA Rafaela,
iiiInstituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Castelar.
bpirola@inti.gob.ar


OBJETIVO
El objetivo general de este trabajo es obtener
un sistema de producción de quimosina
recombinante que permita ensayar y cuantificar
su actividad, con miras futuras de realizar un
mejoramiento en la actividad de la misma
mediante técnicas de biología molecular. El
objetivo específico del presente trabajo es
expresar en forma soluble y activa quimosina
de camello recombinante.

DESCRIPCIÓN
La quimosina es una enzima proteolítica de
peso molecular de 35 kDa aproximadamente
que se utiliza en la elaboración de quesos ya
que las micelas de caseína pueden coagular
por acción de la misma. La quimosina se ha
obtenido originariamente del abomaso de
terneros jóvenes. En los últimos años, la
biotecnología ha posibilitado su reemplazo por
variantes recombinantes de la misma, es decir,
se ha clonado el gen de la quimosina en
microorganismos y éstos se han utilizado para
su producción (Kappeler 2006, Jacob 2010).
El gen utilizado es el de la quimosina de
camello, la cual ha mostrado una mejor
performance de formación de cuajo, con una
proteólisis menor (Tabla 1).

Tabla 1: Comparación entre diferentes quimosinas en
cuanto a la actividad de coagulación y actividad proteolítica
en función de la quimosina bovina.

Actividad de
coagulación de la
leche (% de
quimosina bovina)
Actividad
proteolítica no
específica (% de
quimosina bovina)
Quimosina
bovina
100 100
Quimosina
de camello
170 25
Quimosina
porcina
25 12
Fuente: Budtz 2011.

Para contar con la secuencia genética
completa, el gen de quimosina de camello se
sintetizó por completo y se clonó en el sistema
de expresión pJexpress404 es cual es un
sistema inducible por isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranósido (IPTG).
Para mejorar la expresión en E. coli, se realizó
una optimización del uso de codones, es decir,
se modificó la secuencia de ácido
desoxirribonucleico (ADN) para que codifique la
misma proteína, pero usa codones que son
más frecuentes en E. coli. A su vez, se le
agregó un tag de histidinas para posibilitar su
purificación por cromatografía de afinidad.
El sistema de expresión correspondiente a
E. coli permite la expresión de la enzima
recombinante en grandes cantidades, pero esta
sobreexpresión conlleva a la formación de
cuerpos de inclusión que contienen casi
exclusivamente la enzima recombinante.
La proteína recombinante se expresó mediante
la inducción de cultivos de la bacteria
transformada en medio de cultivo Luria Bertani
(LB) mediante el agregado de IPTG e
incubando durante 4 y 24 horas a 37 ºC
(Zhang, 1991).
Luego de la inducción de la expresión se
cosecharon las células por centrifugación a
5000 rpm, 4 ºC durante 15 min. Al pellet celular
se lo resuspendió en buffer 50 mMTris/HCl, 30
mM NaCl. Las células se lisaron en sonicador
mediante 5 pulsos de 30 s de ultrasonido a
potencia 5. Luego se centrifugó nuevamente
separando de esta manera la fracción soluble
de la insoluble (Wingfield, 1995).
Se analizó la expresión y pureza de la proteína
mediantes electroforesis en geles de
poliacrilamida desnaturalizantes (PAGE- SDS)
al 12%.
Se evaluó el poder coagulante según norma
ISO – FIL 157A-2007, corroborando así que la
enzima tiene o no actividad coagulante (si se
expresa y procesa en forma activa).

RESULTADOS
En cultivos inducidos durante 24 h se
observaron cantidades importantes de
quimosina recombinante. Análisis posteriores
mostraron que el alto nivel de expresión resultó
en la formación de cuerpos de inclusión, los
cuales contienen casi exclusivamente la
proteína recombinante (Figura 1).

1 2 M P

Figura 1: PAGE-SDS 12%. Calle 1: fracción solule luego de
lisis celular. Calle 2: Fracción insoluble luego de lisis
celular. M: marcadores de peso molecular Thermo. P: Peso
Molecular.

Sobre los cuerpos de inclusión se ensayaron
diferentes metodologías de redisolución, como
el agregado de urea y posterior diálisis (Figura
2). También se ensayaron metodologías de
lavado y purificación de cuerpos de inclusión
utilizando PMSF, Tritón X-100 y N-Lauril
sarkosina (Narciandi 1991) (Figura 3).

1 2 M P












Figura 2: PAGE-SDS 12%. Calle 1: fracción insoluble luego
de lisis celular. Calle 2: fracción soluble luego de
tratamiento con urea y diálisis. M: marcadores de peso
molecular marca . P: Peso Molecular.

1 2 3 4 5 M P


Figura 3: PAGE-SDS 12%. Calle 1: refencia quimosina de
camello. Calle 2: fracción soluble luego de lisis celular.
Calle 3: fracción soluble luego de lavado de cuerpos de
inclusión. Calle 4: solubilización de cuerpos de inclusión.
Calle 5: fracción insoluble luego de solubilización de
cuerpos de inclusión. M: marcadores de peso molecular
marca. P: Peso Molecular.

Las fracciones solubles obtenidas luego de
estos tratamientos resultaron no ser activas.
En cuanto a las muestras inducidas durante 4
horas la expresión fue mucho menor que a 24 h
(no mostrado). Sin embargo, sobre las
extractos solubles luego de la lisis celular por
ultrasonido se realizaron ensayos de actividad
coagulante y se observó poder coagulante
sobre una de las fracciones. Esto puede
deberse a la presencia de enzima soluble que
no forma cuerpos de inclusión luego de dicho
tiempo inducción dado que no se presenta
sobreexpresión.

CONCLUSIONES
No ha sido posible expresar en forma soluble y
activa quimosina de camello recombinante
luego de 24 horas de inducción. Actualmente
se están realizando ensayos para maximizar la
obtención de proteína en forma soluble y activa
modificando los tiempos de inducción, la
temperatura y las concentraciones de IPTG.

BIBLIOGRAFIA

Budtz, P., Rahbek-Nielsen, H., Van Den
Brink, J., Kappeler, S., Farah Z. (2011). Método
de producción de quimosina no bovina y uso de
la misma. Patente Internacional.
http://patentados.com/patente/metodo-
produccion-quimosina-no-bovina-uso-misma/
Jacob, M., Jaros, D., Rohm, H. (2010).
Recent advances in milk clotting enzymes.
International Journal of Dairy Technology, 64,
14-33.
Kappeler, S.R., Van den Brink, H.(J.)M.,
Rahbek-Nielsen, H., Farah, Z., Puhan, Z.,
Hansen, E.B., Johansen, E. (2006).
Characterization of recombinant camel
Chymosin reveals superior properties for the
coagulation of bovine and camel milk.
Biochemical and Biophysical Research
Communications, 342, 647–654.
Mohanty, A.K., Mukhopadhyay, U.K., Grover,
S., Batish, V.K. (1999). Bovine chymosin:
Production by rDNA technology and application
in cheese manufacture. Biotechnology
Advances, 17, 205–217.
Narciandi, R.E, Quiñones, Y., Morales, J.,
Torrens, I., Herrera, L. (1992). Obtención de
quimosina bovina expresada en forma de
cuerpos de inclusión insolubles en Escherichia
coli. Biotecnología Aplicada, 8, 48-54.
Wingfield, P.T., Palmer, I. & Liang, S. (1995).
Current Protocols in Protein Science. Folding
and purification of insoluble (Inclusion body)
proteins from Escherichia coli. (capítulos 6.5.1
– 6.5.27).
Zhang, Y., Zhou, W., Liu, N., Yang, K. (1991).
Expression of calf prochymosin gene in
Escherichia coli. Chin J Biotechnol., 7(3),169-
75.

116.0

66.2

45.0
35.0
25.0

18.4
14.4
170
130
100
70
55
40
35

25
15

10
170
130

100
70
55

40

35


25
15
10