Determinación de biomasa generada en un
bioproceso productivo por el método masa seca
Cancela Ezequiel, Cedrés Juan Pablo, Catone Mariela, Matos Maria Laura, Caro Carmen, Amedei Hugo Alejandro.
Laboratorio Analítico, Cultivo Celular Masivo INTI-Biotecnología Industrial.
cancela@inti.gob.ar


Objetivos
Evaluar el método de determinación de masa
seca en microorgansimos de interés de la
Industria Biotecnológica, cuantificando su
incertidumbre.

Objetivos específicos
Estimar la incertidumbre relativa asociada a la
medición de masa seca para una cepa de
Escherichia coli.
Estimar la incertidumbre relativa asociada a las
medición de masa seca para una cepa de
Picchia pastoris.

Introducción
La mayoría de los procesos industriales
biotecnológicos implican el crecimiento
controlado de microorganimos o células
animales. A escala productiva, los
microorganismos se emplean para generar
productos de interés, entre ellos, biomasa,
productos generados por el microorganismos
(antibióticos, proteínas recombinantes) o
saneamientos ambientales sobre una matriz
contaminada. Para poder controlar dicho
proceso es necesario estimar la variación de la
cantidad de biomasa del microorganismo en
función del tiempo. Existen varios métodos para
determinar el crecimiento como ser medición de
la densidad óptica determinando absorbancia a
600 nm (OD600), recuento microbiológico en
placas y determinación de la masa seca del
cultivo.
Este método consiste en secar hasta peso
constante un volumen conocido de muestra y
determinar su masa gravimétricamente. La
variación de la masa seca en función del tiempo,
es la forma más utilizada para calcular el
rendimiento productivo a lo largo del proceso.
La forma tradicional de evaluar el rendimiento de
un bioproceso en función del sustrato
consumido (Yx/s) se describe mediante la
siguiente ecuación:

=
∆
∆ (Ec.1)


donde ΔX es la biomasa obtenida en el proceso,
ΔS representa el sustrato principal empleado
para crecer el microorganismo.
Dado que estos procesos requieren el control de
crecimiento de la biomasa, es fundamental la
estandarización y optimización del método
teniendo en cuenta el adecuado
dimensionamiento del volumen empleado para
realizar las cuantificaciones y los procesos
preparativos adicionales.
Un resultado analítico, apto para su uso, implica
que el mismo sea lo suficientemente fiable para
que cualquier decisión basada en él, pueda ser
tomada con confianza. Debe validarse el
desempeño del método y estimar la
incertidumbre del resultado, para un
determinado nivel de confianza (1).
La incertidumbre asociada a la precisión
intermedia (SRW) debe evaluarse bajo el mismo
método, la misma muestra homogénea, en un
solo laboratorio, con diferentes analistas, con
distinto equipamiento con intervalos de tiempo
representativos de las actividades cotidianas del
laboratorio. La misma puede calcularse a partir
del promedio de cuadrados entre grupos
obtenidos en el ANOVA, utilizando los
cuadrados medios entre y dentro de los grupos
según las ecuaciones 2 (2).

= + (Ec.2)

= ( !" − $ !" %)’
= $ !" %


donde s2mues se obtiene restando el cuadrado
medio entre grupos (CMentre) y el cuadrado
medio dentro de grupos (CMdentro), sobre el
número de réplicas (n). sr2 es el cuadrado de la
desviación estándar asociada a la repetibilidad
del método. Si dicha incertidumbre se divide por
el promedio de las determinaciones totales
realizadas, se obtiene una incertidumbre relativa
denominada en este trabajo como urs.
La expresión de la incertidumbre combinada
relativa porcentual del método (uc(y)%) se
expresa como según la ecuación 3 (Ec.3).

78(9)%
= 100 × =
× 7> + 7>? + 7>@
(Ec.3)

donde k es el factor de cobertura considerado
como 2. urs es la incertidumbre relativa a la
precisión intermedia, urg es la incertidumbre
relativa asociada por gravimetría y urv es la
incertidumbre relativa asociada por volumetría.
El presente estudio propone el cálculo de la
incertidumbre porcentual relativa de medición de
Masa seca asociada a una cepa de E. coli, y a
una levadura unicelular muy utilizada en
Biotecnología como lo es P. pastoris.

Descripción
Se realizó un estudio de precisión intermedia del
método sobre dos microorganismos: la bacteria
E. coli y la levadura P. pastoris. El ensayo fue
realizado considerando todas las variables
implicadas en el método (distintos analistas e
instrumentos de medición), con la salvedad de
que por las características de la muestra se
realizó el ensayo en un día de trabajo.
El cálculo de incertidumbre relativa combinada
final (Ec.3) expresada con un 95% de confianza
(k = 2) involucró la incertidumbre de los
instrumentos de medición (Ec.1) y la
incertidumbre asociada al estudio de precisión
intermedia (Ec.2).

Resultados
Para el cálculo de la desviación estándar relativa
asociada a la incertidumbre por gravimetría se
utilizó la incertidumbre de 0,1 mg (3) en el rango
utilizado. Además, el promedio de pesos
obtenido para P. pastoris fue de 10,8 mg y 7,8
mg para E. coli. Las incertidumbres relativas
calculadas fueron: para las muestras de P.
pastoris fue 0,009 g y para E. coli fue de 0,013
g.
En relación al cálculo de la incertidumbre relativa
asociada a los volúmenes de trabajo, la
incertidumbre para la pipeta utilizada fue de 10
µl (4). El volumen empleado para P. pastoris fue
de 0,7 y para E.coli de 3,2 ml.
Las incertidumbres relativas calculadas para la
gravimetria (urg) y volumetría (urv) fueron
calculadas según las ecuaciones 4 (Ec.4) y 5
(Ec.5) respectivamente:

7>? = 7(?) ? (Ec.4)

7>@ = 7(@) @ (Ec.5)
donde u(g) y u(v) son las incertidumbres del
instrumento gravimétricos y volumétricos, g y v
se corresponden con el peso y el volumen
medido respectivamente.
La precisión intermedia (Srw) calculada según la
ecuación Ec.2 fue dividida por el promedio de las
mediciones realizadas obteniéndose el término
urs (Ec.3). Finalmente los resultados (uc%) que
se expresan en la tabla 1 fueron calculados
utilizando la ecuación 3 (Ec.3).

Tipo
celular

Clasificación

Organismo

Valor
determina
do (g/l)
uc%

Procariota Bacteria E. coli 2,4 11,7
Eucariota Levadura P. pastoris 15,4 12,5
Tabla 1: Resultados de las incertidumbres calculadas para
distintos microorganismos sobre muestras de distintos
contenido de masa seca.

Con el fin de estudiar de forma generalizada las
incertidumbres de medición, comparar el
comportamiento de cada organismo respecto
del peso seco detectado, trabajar con una
cantidad constante de muestra a secar y que a
su vez sea la menor cantidad de muestra
destructiva utilizada, se evaluó el volumen de
cultivo necesario para obtener 8 mg (superior al
límite de cuantificación de la técnica) de peso
seco normalizada respecto de la OD600 de
cultivo para cada cepa, como “factor” (Figura 1).



Figura 1: Comparación de los distintos factores
obtenidos para bacterias (gama de verdes) y para
levaduras (gama de naranjas).

Conclusiones
Este estudio le permitirán al Centro de
Biotecnología Industrial satisfacer
requerimientos metrológicos tanto de empresas
biotecnológicas nacionales como propios. Se
observa una variación de la incertidumbre
creciente con la cantidad de analito medida para
los valores de células testeados.
Al calcular las incertidumbres relativas en
distintos valores de analito (2,4 g/l para E. coli y
15,4 g/l para P. patoris) se observan
0
5
10
15
20
25
30
35
40
LB LB LB
M
RS YP
D
YP
D
Sin
té
tic
o
Fa
ct
or
(
m
l/O
D)

incertidumbres de medición crecientes,
sugiriendo que la forma más adecuada para la
expresión de la incertidumbre en el rango
evaluado es la incertidumbre relativa.
El cálculo de incertidumbre fue realizado
considerando la incertidumbre generada por la
precisión del método más el estudio de la
incertidumbre asociada a la exactitud, la cual se
basó en la propagación de incertidumbres del
instrumental, lo cual explica en gran medida la
incertidumbre asociada al sesgo dado que la
pesada final es la que define el valor a expresar
y no se requiere para dicho método interpolar en
una curva de estándar como en la mayoría de
otros métodos. Una alternativa para estimar la
incertidumbre asociada al sesgo, sería realizar
el clásico estudio con un material de referencia,
del cual no se dispone.
Se requieren estudios posteriores a fin de
obtener un estimación generalizada de la
incertidumbre del método aplicable a todas las
cepas que se muestras en la figura 1.

Bibliografía

(1) Eurolab Española. P.P. Morillas y colaboradores.
Guía Eurachem: La adecuación al uso de los métodos
analíticos- Una Guía de laboratorio para la validación
de métodos y temas relacionados (1° ed. 2016).

(2) Curso de validación de Métodos Analíticos y
Control de Calidad en Laboratorios. Intituto Nacional de
Tecnología Industrial. 3, 4 y 5 de mayo 2017. Lic. Pablo
Alvarez.

(3) Certificado de calibración / medición para balanza
analítica Sartorius (RUT- N°102-3438/U) Centro de
Investigación y Desarrollo Física y Metrología – INTI.

(4) UNE-EN-ISO 8655-2: 2002. Madrid: AENOR;
2002ISO 8655 Calibracion de Pipetas. Apartado 2.