Desarrollo de Material de referencia Certificado (CRM) de
Albúmina de Suero Bovino (BSA)
Amedei Hugo Alejandro1, Juan Pablo Cedrés1, Toyé Laura 1, Nigro Fabián1, Gatti Patricia2, Cappa María de los Ángeles3.
INTI-Biotecnología Industrial1, Gerencia de Metrología, Calidad y Ambiente2, Gerencia de Innovación Desarrollo3.
Amedei@inti.gob.ar


Objetivos
Desarrollar, producir y caracterizar un Material
de Referencia Certificado de Albúmina de
Suero Bovino, conteniendo 140mg de la
proteína de alta pureza. Establecer trazabilidad
en las determinaciones analíticas sobre
productos proteicos de las industrias
Biotecnológicas, laboratorios clínicos e
investigación y países en la región Latino-
Americana y de Caribe.
Generar un equipo de trabajo con otros
institutos nacionales de Metrología de la región
para el desarrollo conjunto de estos materiales
entre los que se encuentra Argentina (INTI),
México (CENAM) y Brasil (INMETRO),
beneficiará sinérgicamente el avance en el
campo proteómico dando la sustentabilidad a
las Mediciones en la región.

Objetivo Específico
Diseñar una propuesta de proyecto que permita
la producción conjunta a nivel nacional de MRC
de BSA, incluyendo las necesidades de
materiales y gastos para la producción de lotes
de 550 viales de MRC de BSA.

Introducción
La biometrología es la ciencia de las
mediciones aplicadas al campo de la biología.
Los materiales de referencia certificados (MRC)
sustentan el establecimiento de la trazabilidad
metrológica de las mediciones elementales que
realizan los laboratorios analíticos. Es
necesario contar con MRC y con métodos
validados que permitan alcanzar resultados
confiables, ya que éstos se usan con fines
regulatorios, legales o simplemente generan
avances firmes y confiables en los campos de
aplicación (1).
En particular Latinoamérica carece
circunstancialmente de producción de MRC de
BSA de alta pureza.
Dentro de los materiales de referencia de uso
en biología se pueden citar al suero humano
congelado del CENAM y células somáticas
INTI.
En el mundo hay dos institutos metrológicos
que producen este MRC, uno es el Instituto
Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) de
Estados Unidos (2) quien produce una solución
proteica de BSA al 7% y el otro es el Instituto
Nacional de Metrología de China NIM (3) quien
produce un liofilizado proteico de BSA.
Este proyecto se presentó a una convocatoria
del SIM (Sistema interamericano de metrología)
bajo la temática de fortalecimiento metrológico
Regional, en la cual Participaron 19 proyectos.
El proyecto persigue desarrollar el material de
referencia por medio de una colaboración
regional. Contempla el desarrollo del material a
cargo de INTI y la certificación a coargo de los
otros integrantes del proyecto, con una
duración de dos años a partir de julio de 2017.
El Centro de Investigación y desarrollo del
Biotecnología Industrial del INTI, Argentina,
dispone de una planta piloto para producción
de proteínas de alta pureza, con tecnología de
punta en el campo. Y es de interés para el país
mejorar la calidad y trazabilidad de las
mediciones en biometrología, siendo
responsabilidad del INTI establecer trazabilidad
metrológica de las mediciones en el territorio
nacional.
La purificación proteica es un paso clave para
la obtención de un material de referencia
candidato a ser caracterizado y certificado. Al
mismo tiempo contiene parámetros específicos
que hacen que el proceso pueda llevarse a
cabo tanto física como económicamente. Por lo
tanto, la realización de ensayos previos a baja
escala es clave, para definir y caracterizar la
preparación del MRC.
En este artículo se muestra el inicio del
desarrollo del Primer material de referencia
proteico latinoamericano, cuyo alcance se limita
a establecer la cantidad de material de partida
y resina para producir 1 lote de 550 viales, y
estimar la capacidad productiva máxima por
lote del MRC.

Descripción
Se realiza la preparación del material,
realizando una purificación por columna de
intercambio aniónico fuerte, a mini-escala, en el
equipo “Akta Purifier”, cromatógrafo de flujo
rápido para purificación proteica. Las distintas
fracciones de purificación obtenidas se
muestran en la figura 1, dichas fracciones
fueron caracterizadas cuantificando proteínas
totales por método DOC-TCA Lowry (Ver tabla
1) y explorando perfiles proteicos de
purificación por Electroforesis SDS-PAGE

tinción coomassie Coloidal (figura 2) y las
impurezas se estudiaron por Electroforesis
SDS-PAGE tinción plata (figura 3).
Resultados
La tabla 1 muestra los resultados obtenidos de
la purificación por proteínas totales para las
fracciones mas importantes de la purificación,
en la figura 1 se muestran los perfiles
cromatografico obtenidos, mientras que en la
figuras 2 se presentan los perfiles proteicos de
cada fracción del proceso.
Nombre de
la Fracción
Proteínas
totales
Rendimiento
Siembra 55mg 75%
Fracción 8-9 42mg
Tabla 1: La tabla muestra los resultados cuantitativos
obtenidos sobre la fracción ingresada (siembra) y
Purificada (F-8-9) determinados por el método de
cuantificación de proteínas totales DOC-TCA Lowry.



Figura 1: Cromatograma de purificación de BSA, a
partir de material comercial.

Figura 2: Fotografía SDS-PAGE 16%, Tinción
coomassie blue coloidal.
Por otro lado se evaluó la pureza de la fracción
8-9 (calle 09 de la figura 3). La misma resultó
purificada para proteínas mayores a 66KDa,
pero se observan claramente impureza de
menor peso molecular.

Figura 3: Gel SDS-PAGE, Tinción plata. Muestra las
impurezas proteicas aun presentes en la siembra y F 8-
9. La flecha muestra la proteína BSA a purificar.

Conclusiones
A partir de este ensayo se logró establecer un
protocolo analítico para verificar el proceso de
purificación proteico, el mismo deberá ser
perfeccionado.
Además se pudo evaluar que la resina utilizada
presenta un buen rendimiento de purificación
de la proteína, obteniendo 42 mg de BSA por
mililitro de resina, lo cual nos da una pauta de
la viabilidad industrial del proceso (Tabla 1).
Para nuestro caso un lote de 550 viales, se
espera partir de 930 ml de material de partida
(Solución impura de BSA al 7%) y se proyecta
utilizar 1,8 litros de resina de Intercambio
Iónico. En cuanto a la capacidad productiva
máxima, el centro de biotecnología Industrial
cuenta con equipos de cromatografía que
pueden emplear más de 80 litros de resina, por
ende, purificar 3,3 Kgr Material de referencia
por lote en 1 semana.
Analizando las impuresas, es evidente que se
debería optimizar el proceso de Purificación
dado que se detectan impurezas proteicas de
peso molecular menor a 66KDa (figura 3), de
todos modos, no es objetivo de este primer
esnsayo.
Este desarrollo será realizado por el centro de
Biotecnología Industrial en el marco de la
Biometrología hasta certificar el MRC en Junio
del 2019.

Agradecimientos
Héctor Laiz por la lectura e impulso de la
propuesta, a Gabriel Sternik por corrección del
proyecto en versión Inglesa, Laura Matos por la
articulación de actividades y espacios para
realizar el ensayo, Carmen Caro, Cancela
Ezequiel, Joaquín Molina por intervenciones
analíticas, Leandro Navarro soporte
Purificaciones, Daniel Kapitonozyk lavado y
acondicionamiento de materiales.
A Kirsten Mahon (Universidad de Virginia Tech,
Estados Unidos), por la revisión del Inglés
técnico en la presentación realizada ante el
SIM.
Bibliografía
1. John Marriott, Gavin O’Connor, Helen Parkes- Final
Report Study of Measurement Service and Comparison
Needs for an International Measurement Infrastructure for
the Biosciences and Biotechnology: Input for the BIPM
Work Program. 04-03-2011. Rapport BIPM 2011/02.
2. Certificate of Analysis Standard Reference Material 927d,
Bovine Serum Albumin (7% solution) NIST (Certificate
Issue Date: 25 March 2014). Expiration of Certification: 30
of Septiembre 2016.
3. Liqing Wu, Bin Yang, Jiaming Bi, King Wang.
Development of bovine serum albumin certified reference
material. Anal Bianal Chem (21/04/2011) 400:3443-3449.