DETECCIÓN DE TRAZAS DE SOJA EN PRODUCTOS ELABORADOS CON HARINA DE TRIGO
UTILIZANDO MÉTODOS DE ELISA Y REAL TIME-PCR

Vivas Lis M. **, Binaghi M. Julieta*, Olmedo Mariana C. **, Hostench M. Clara **, López Laura B.* y
Alvarez Marcela A.**,
*Cátedra de Bromatología. Departamento de Sanidad, Nutrición, Bromatología y Toxicología.
Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. Junín 956. C.P. 1113. Buenos
Aires. Argentina. FAX: 541149648243.
**
Centro de Agroalimentos, Coordinación Microbiología y Biología Molecular, Instituto Nacional de
Tecnología Industrial. Av. General Paz 5445. San Martín, Provincia de Buenos Aires, Argentina.
maa@inti.gob.ar


INTRODUCCIÓN
Las alergias alimentarias constituyen un
problema creciente en los países desarrollados
pero también en los países emergentes.
Existen 8 grupos de alimentos que son
responsables del 90 % de las alergias
alimentarias. Estos alimentos son: leche,
huevo, soja, trigo, maní, frutos secos, pescado
y mariscos. La reacción alérgica frente a este
tipo de alimentos se puede manifestar desde
prurito o urticaria hasta el shock anafiláctico
dependiendo del individuo y a su vez la
intensidad de esta respuesta puede variar a lo
largo de su vida. Se estima que las alergias
alimentarias afectan al 3-4% de adultos y a 4-
7% de los niños en los países desarrollados
(Wang y Liu, 2011; EAACI, 2013). Estos
alérgenos generalmente empiezan a tolerarse
en niños con edades comprendidas entre los 5
y 7 años.
La mayor preocupación para los individuos
alérgicos a la soja reside en la posibilidad de
consumir alimentos que presenten soja por
contaminación cruzada. Esta ocurre en el
transporte o almacenamiento de la materia
prima, pero también puede ocurrir cuando se
comparten las maquinarias de elaboración y de
envasado con productos con soja como
ingrediente.
Es por ello, la importancia de desarrollar y
evaluar tecnologías que permitan la detección
de soja como contaminante.


OBJETIVO
El objetivo del presente trabajo es
evaluar dos metodologías real time PCR
(Polymerasa Chain Reaction) y la metodología
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay:
ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas)
para la detección y/o cuantificación de trazas
soja en alimentos elaborados con harina de
trigo susceptibles de contaminación cruzada.
Se trabajó con muestras de harinas, pastas y
galletitas.

DESCRIPCIÓN

Muestras: se analizaron 11 muestras que
pueden presentar contaminación cruzada con
soja. Las muestras estudiadas fueron: pasta
seca 100 % trigo candeal, pasta seca 100%
trigo pan; galletitas Cracker con lecitina,
galletitas Cracker de salvado con lecitina;
harina 000 industrial, harina 000 y harina 0000,
salvado de trigo

Métodos: Se estudiaron las muestras por la
técnica de ELISA y por dos métodos de Real
Time-PCR.
ELISA RIDASCREEN (R) FAST Soya, R-
Biopharm.
Se utilizó este kit para el análisis cuantitativo de
soja. Todas las muestras se analizaron por
duplicado siguiendo el protocolo de trabajo del
kit. Los resultados obtenidos, utilizando el kit de
ELISA, se expresan en ppm de proteína de
soja. Este kit presenta un límite de
cuantificación de 2,5 mg/kg (ppm) proteínas de
soja y un rango de cuantificación: 2,5 – 20,0
ppm proteínas de soja.
REAL TIME PCR
Extracción de ADN (Acido Desoxiribonucleico)
Para la extracción de ADN se utilizaron dos
metodologías: 1) el kit de extracción de ADN,
SureFood ® PREP ALLERGEN de R-Biopharm
y 2) método de extracción de ADN utilizando
CTAB (bromuro de cetil-trimetil amonio) con
posterior paso de purificación mediante Wizard
®
DNA Clean-Up System.
Amplificación del ADN

Método 1: Kit para la detección cualitativa de
ADN de soja de R-Biopharm (SureFood®
Allergen Soya)

Todas las muestras se analizaron por duplicado
siguiendo el protocolo de trabajo del kit. Para la
obtención del ADN se utilizó el kit de extracción
SureFood ® PREP ALLERGEN de r-Biopharm.
El kit utilizado permite obtener resultados
cualitativos.
El límite de detección del kit comercial obtenido
con el material de referencia SureFood ®
Quantard Allergen, extraído con el kit
SureFood ® PREP ALLERGEN es de 4 ppm de
soja y fue detectado en el ciclo 30 (Ct) (2).Este
valor es de gran utilidad para la interpretación
de los resultados obtenidos, dado que si una
muestra es amplificada antes del ciclo 30,
indicaría que la misma presenta más de 4 ppm
de soja. Por lo tanto, para evaluar los
resultados se utiliza como punto de corte este
valor de Ct para definir si una muestra es
positiva. Sin embargo, el límite de detección
depende de la matriz, del grado de
procesamiento de la misma y del método
extracción de ADN utilizado. El parámetro Ct
(threshold cycle) está definido como el número
de ciclos en los que la fluorescencia emitida
excede el umbral fijado. Los valores de Ct son
inversamente proporcionales a la concentración
inicial de ADN presente en la muestra.

Método 2: Método in-house (1)(3)

Método in-house que se basa en la detección
del gen de lectina, secuencia específica de
soja. Los cebadores y sonda utilizados fueron:
Cebador FW (Lectin-F) 5´-TCC ACC CCC ATC
CAC ATT T-3´, Cebador R (Lectin-R) 5´-GGG
ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA-3´, Sonda
(Lectin-Probe) 5´-FAM AAC CGG TAG CGT
TGC CAG CTT CG-TAMRA-3´. Se utilizaron
controles positivos para asegurar el
funcionamiento del método.
En cuanto al método in-house el límite de
detección aún no ha sido determinado.

RESULTADOS


Muestra
ELISA (ppm
proteínas de
soja)
PCR
Método 1
PCR
Método 2
Pasta Seca
100 %
candeal
< 2,5 Positivo 29.7 Neg.
Pasta seca
100 % trigo
pan
14,3 Positivo 24.3 Neg.
Galletitas
Cracker
salvado
con lecitina
13,9 - Neg.
Galletitas
Cracker
con lecitina
6,2 - Neg.
Harina 000 > 20 Positivo 25.6 Neg.
Harina 000
Industrial > 20
Positivo
26.1

Neg.


Muestra
ELISA (ppm
proteínas de
soja)
PCR
Método 1
PCR
Método 2
Harina 000 16 Positivo 28.4 Neg.
Harina 000 12 Positivo 24.4 Neg.
Harina
0000 < 2,5
Positivo
27.9 Neg.
Salvado de
trigo < 2,5
Positivo
28.2 Neg.
Salvado de
trigo 9,5 - Neg.

Según el método de ELISA, 8 muestras de las
11 analizadas (73%) presentan contaminación
cruzada con soja.
Por otro lado, ambos métodos de PCR no
dieron resultados comparables

CONCLUSIONES

El método de ELISA detecta la proteína
alergénica y el de PCR detecta ADN de soja.
Si bien no son métodos comparables, se
complementan.
En cuanto a que ambos métodos de PCR no
hayan dado resultados comparables, esto
puede deberse a que se presume que la
cantidad de ADN de soja presente en estas
muestras es menor al límite de detección del
método in-house, de allí que hayan dado
negativas.
Si bien el objetivo del trabajo se cumplió, en
una próxima etapa se trabajará en obtener el
límite de detección en distintas matrices, con el
fin de evaluar la sensibilidad de este método.


BIBLIOGRAFÍA
(1)Molecular Biological and Inmunological
Techniques and Applications for Food
Chemists, Edited by Bert popping, Carmen
Díaz-Amigo, Katrin Hoenicke, A John Wiley &
Sons, Inc., Publication 2010.
(2)
”Detección de presencia de soja por
contaminación cruzada en alimentos
comerciales por método Real time PCR y
métodos de ELISA” Cattapan Renata1,
Cellerino Karina2, Binaghi M. Julieta2, Cinalli
Mariana1, Cetrangolo Mercedes1, Hostench M.
Clara1, Alvarez Marcela A1, López María
Cristina1 y López Laura B1. 1INTI-
Agroalimentos, 2Cátedra de Bromatología.
Departamento de Sanidad, Nutrición,

Bromatología y Toxicología. Facultad de
Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos
Aires. Revista la Alimentación Latinoamericana
Nº 303 Abril 2013.
(3)Cuaderno Tecnológico: Detección por PCR
de alérgenos en alimentos, OGM, e
identificación de especies. Autores: Dra.
Carmen Díaz Amigo, Dr. Bert Popping, 2014.