INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA INDUSTRIAL 1

Estudio del proceso de descontaminación de desechos de laboratorio
de microbiología en bolsas de polipropileno por esterilización en
autoclave a vapor saturado

Giannavola, C.; Svensen, A.; Alarcón, C.; González, V.

INTI-Carnes
Introducción
Un principio básico de la bioseguridad indica que
todo material contaminado debe ser
descontaminado previo a su disposición final. La
descontaminación comprende la esterilización
(completa destrucción de todos los
microorganismos, incluyendo esporas bacterianas)
y la desinfección (eliminación de microorganismos,
pero no necesariamente esporas).
Las autoclaves a vapor saturado son
habitualmente utilizadas por laboratorios de
microbiología para descontaminar desechos
biológicos por esterilización. Es usual la colocación
del material a descontaminar en bolsas plásticas,
las cuales son ubicadas en la autoclave para su
posterior tratamiento.
En la bibliografía [1][2][3] se presentan procesos o
ciclos de esterilización (condiciones
tiempo/temperatura) recomendados a modo de
guía (p.e. 30 minutos a 121 °C), los cuales suelen
ser adoptados por los laboratorios sin previa
validación de su eficacia en función de las
características de la carga. Se utilizan
periódicamente indicadores biológicos (p.e.
esporas de B. stearothermophilus) para el control
de esterilidad, los cuales no siempre es posible
colocarlos dentro de las bolsas, en su punto de
calentamiento más lento. Este requisito es
indispensable para asegurar la adecuada
destrucción microbiana en toda la carga. Debido a
las distintas características del material a
descontaminar (placas de Petri, bolsas de
stomacher, etc.) y de la bolsa que lo contiene
(material, espesor, tamaño, simple o doble bolsa,
etc), es de esperar una marcada variabilidad en los
perfiles de temperatura en el interior del material
durante el proceso térmico en la autoclave; la
temperatura en dicho punto aumentará con mayor
o menor velocidad, variando así la eficacia del
proceso aplicado. Reglamentaciones actuales [4][5]
hacen un mayor hincapié en la determinación de
ciclos de esterilización adecuados a las
características particulares de la carga a
descontaminar, en base a ensayos de penetración
de calor. Se prevé que los factores citados en
relación al material a descontaminar y su envase,
así como también la forma de carga de la
autoclave, puedan provocar una prolongación del
tiempo de proceso a una dada temperatura de la
autoclave.
Si bien en la bibliografía [6][7][8] se hallan trabajos
en los cuales se ajustaron (prolongaron) los
tiempos de esterilización usados para
descontaminar desechos de laboratorio de
características definidas en base a estudios de
penetración de calor, los mismos se hicieron
calculando tiempos desde que el centro del
material a descontaminar alcanzaba la
temperatura deseada (usualmente 121 °C). Este
modo de trabajo requiere repetir ensayos para
cada temperatura de esterilización propuesta, no
permitiendo ningún tipo de extrapolación. El
Centro INTI-Carnes se ha especializado en
procesos térmicos aplicados a la industria
alimentaria y realiza habitualmente estudios de
penetración de calor en productos envasados (ej.
latas de conserva) con el objeto de validar
procesos de esterilización actuales o bien para su
diseño. En esta industria está ampliamente
difundido el concepto de Valor de Letalidad o valor
Fo, que permite comparar la eficacia de distintos
ciclos de esterilización a través de esquemas de
cálculo definidos.
El objetivo del trabajo fue aplicar los conceptos y
programas de cálculo [9] que constituyen la base
de los estudios que el Centro realiza habitualmente
a nivel industrial, para establecer ciclos de
esterilización eficaces de acuerdo a un dado
criterio de inactivación microbiana, para la
descontaminación de una carga típica de material
de desecho de un laboratorio de microbiología de
alimentos contenido en bolsas de polipropileno, en

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una autoclave a vapor saturado tipo Chamberland.
Los ensayos de penetración de calor se realizaron
en bolsas cargadas con placas de Petri, las cuales
constituyen el material de desecho del laboratorio
de microbiología del Centro que ofrece la mayor
resistencia a la transferencia de calor (caso más
desfavorable).
Metodología
Se colocaron termocuplas de cobre-constantán –
tipo T- (Ellab A/S, Dinamarca) en el interior de
bolsas de polipropileno de 30 cm x 60 cm, 80
micrones (2MS, BDVH 30 x 60) cargadas en forma
completa con placas de Petri descartables
sembradas (43-70 placas de Petri por bolsa,
promedio: 59). El peso de las bolsas se encontró
en el rango 1,40 – 2,45 kg (promedio: 1,90 kg).
Dimensiones de las bolsas cargadas: 15 cm x 23
cm x 34 cm. La junta de medición de la
termocupla se ubicó sobre el eje longitudinal, entre
las placas de Petri, a 17 cm del fondo (punto de
calentamiento más desfavorable debido a la
compactación de la carga sufrida durante el
proceso de esterilización). Adoptando el criterio de
G. Ozanne y colaboradores [6], cada bolsa se
procesó cerrada (se ató con hilo) y sin adición de
agua.
En cada ensayo se cargaron tres bolsas con las
termocuplas en una autoclave de laboratorio tipo
Chamberland (VZ modelo 75L, Villar y Zaurdo
SRL, Argentina), calefaccionada a gas natural, de
75 dm3 de capacidad (diámetro: 40 cm; altura: 60
cm), con control manual. Este es el máximo
número de bolsas permitido por las dimensiones
de la autoclave, quedando las mismas en contacto
lateral. Se colocó una termocupla en la cámara
(ambiente) para el seguimiento de la temperatura
de proceso. Las termocuplas se conectaron a un
sistema de adquisición de datos (HYDRA 2625A,
Fluke, USA) para el registro y almacenamiento de
los valores de temperatura.
Las termocuplas utilizadas fueron previamente
calibradas siguiendo procedimientos que aseguran
la trazabilidad a patrones nacionales.
Una vez cerrada la autoclave, se encendió el
equipo, dando comienzo el ensayo. El tiempo de
venteo (eliminación del aire de la cámara) se ubicó
en el rango 40 - 59 minutos. El tiempo de puesta
en régimen (tiempo que el equipo tarda en
alcanzar la temperatura de proceso) resultó entre
52 y 62 minutos. La temperatura de proceso fue
de 121 °C en todos los ensayos. Esta temperatura
se mantuvo durante un tiempo de 50 minutos. Se
midieron las temperaturas desde el comienzo de la
calefacción de la autoclave a intervalos de 4
minutos hasta su finalización.
Se ensayaron 15 bolsas en total.
Los registros de temperatura de las bolsas y del
ambiente en función del tiempo se volcaron en los
programas de cálculo [9] a fin de determinar los
parámetros característicos de penetración de calor
fh (tiempo para reducir la diferencia entre la
temperatura de proceso y la del punto en estudio
en un 90 %) –indicativo de la velocidad de
calentamiento-

y jh (factor de retardo de la curva
de calentamiento).
Posteriormente, se determinó estadísticamente la
muestra (bolsa) cuya velocidad de penetración de
calor representó el caso más desfavorable. Para
ello se estableció un límite de confianza teniendo
en cuenta la variación en el parámetro fh; se tomó
P < 0,0025 para la probabilidad de un valor mayor
(corresponde a un nivel de confianza de 99,75 %).
A partir del valor fh calculado de esta forma (fh,p),
que equivale a una probabilidad de 1 en 400 de
que alguna muestra posea un valor mayor, y del
factor de retardo jh promedio para la totalidad de
las muestras, se calculó el tiempo del ciclo de
esterilización necesario para alcanzar un valor Fo
prefijado de 15 minutos en el punto de
calentamiento más lento de la carga. Este valor Fo
se corresponde con el criterio de mantener durante
15 minutos una temperatura de 121 °C en dicho
punto, adoptado por otros autores [5][6] como
adecuado para lograr una eficaz esterilización.
A través de los programas de cálculo se
establecieron tiempos de esterilización para
distintas temperaturas de posible interés.
Resultados
En la Figura 1 se muestra una curva típica de
calentamiento de las bolsas en una autoclave tipo
Chamberland.

Figura 1: Calentamiento de una bolsa de polipropileno 30
cm x 60 cm con placas de Petri, procesada a 121 °C en una
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
110,0
120,0
130,0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Tiempo (minutos)
Te
m
pe
ra
tu
ra

(°C
)
Autoclave Bolsa

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autoclave tipo Chamberland.

En la Tabla I se han volcado los parámetros
característicos de penetración de calor fh y jh
calculados para las muestras ensayadas.
Tabla I. Parámetros característicos de penetración
de calor.
Muestra N° fh (minutos) jh (minutos)
1 48,8 0,66
2 34,5 0,75
3 39,2 0,73
4 30,0 0,98
5 46,7 0,59
6 28,0 0,55
7 32,1 0,59
8 37,6 0,64
9 35,9 0,58
10 52,0 0,75
11 31,2 0,78
12 28,6 0,82
13 25,6 0,64
14 26,1 1,47
15 31,6 1,01

A partir de los valores fh individuales se calculó el
parámetro fh,p, el cual resultó igual a 61,8 minutos.
El tiempo para el ciclo de esterilización a 121 °C
necesario para alcanzar un valor Fo de 15 minutos
en el punto de calentamiento más lento de la
carga resultó de 75 minutos.
Siguiendo el tradicional criterio establecido por C.
O. Ball [10], en el procedimiento de cálculo utilizado
para la determinación del tiempo del ciclo de
esterilización se consideró que el último segmento
del tiempo de puesta en régimen (promedio), cuya
longitud es igual al 40 % de su duración total, se
puede asumir como tiempo a temperatura de
proceso.
En la Tabla II se muestran los tiempos de ciclos de
esterilización calculados para otras temperaturas
de proceso.
Tabla II. Ciclos de esterilización para
descontaminación de bolsas de polipropileno 30
cm x 60 cm con placas de Petri en una autoclave
tipo Chamberland.



Temperatura de proceso
(°C)
Tiempo de proceso
(minutos)
121 75
123 65
126 55
130 46

Conclusiones
A partir de conceptos y programas de cálculo
habitualmente utilizados para el diseño y
validación de procesos de esterilización de
conservas alimenticias, se determinaron ciclos de
esterilización para la descontaminación de
desechos de laboratorios de microbiología en
bolsas de polipropileno de características definidas,
en autoclaves a vapor tipo Chamberland, con
dadas condiciones operativas, en base al criterio
de mantener durante 15 minutos una temperatura
de 121 °C en el punto de calentamiento más lento
de la bolsa que estadísticamente representa el
caso más desfavorable de esa población.
Los ciclos de esterilización establecidos en el
presente trabajo son válidos para las condiciones
de carga y operativas ensayadas. La metodología
presentada podrá aplicarse para la determinación
de procesos de descontaminación con otras
condiciones (simple/doble bolsa, tipo y forma de
carga, autoclave, etc.).
A partir del uso de ciclos de esterilización
calculados para las condiciones de trabajo
específicas de cada laboratorio, se posibilitará
bajar la frecuencia de los controles con indicadores
biológicos empleados habitualmente en los
procesos de descontaminación de desechos.
Agradecimientos
Marcela Álvarez (INTI-Cereales y Oleaginosas)
Referencias
[1] A. D. Eaton, ed., L. S. Clesceri, ed., E. W. Rice, ed., A. E.
Greenberg, ed. “Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater”, Part 9000 “Microbial Examination”,
APHA, 21st ed., 2005.
[2] OMS. “Manual de Bioseguridad en el Laboratorio”, 3ª ed.,
Ginebra, 2005.
[3] ISO 7218:1996/Amd 1:2001. “Microbiology of Food and
Animal Feeding Stuffs – General Rules for Microbiological
Examinations”.
[4] Public Health Agency of Canada. “The Laboratory Biosafety
Guidelines”, 3rd. ed., 2004.
[5] Department of the Army. “The Biological Defense Safety
Program, Technical Safety Requirements”, CFR Title 32–
National Defense, Chapter V, Part 627, 2006.
[6] G. Ozanne, R. Huot, C. Montpetit. “Influence of Packaging
and Processing Conditions on the Decontamination of
Laboratory Biomedical Waste by Steam Sterilization”, Applied
and Environmental Microbiology 59, pp 4335-4337, 1993.

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[7] W. A. Rutala, M. M. Stiegel, F. A. Sarubbi, Jr.
“Decontamination of Laboratory Microbiological Waste by
Steam Sterilization”, Applied and Environmental Microbiology
43, pp 1311-1316, 1982.
[8] J. L. Lauer, D. R. Battles, D. Vesley. “Decontaminating
Infectious Laboratory Waste by Autoclaving”, Applied and
Environmental Microbiology 44, pp 690-694, 1982.
[9] A. I. Svensen, N. L. Rodríguez, E. A. Viviani. “Diseño del
Proceso Térmico por Computadora”, NOTICITECA N° 65, vol.
11, pp 73-79, 1981.
[10] C. O. Ball y F. C. W. Olson. “Sterilization in Food
Technology”, Mc Graw-Hill Book Company, Inc., 1957.


Para mayor información contactarse con: Giannavola, Carolina
cgiannavola@inti.gov.ar