INMUNOSENSOR PARA LA CUANTIFICACION DE
ALERGENOS ALIMENTARIOS UTILIZANDO TINTAS CON
NANOTUBOS DE CARBONO Y PARTICULAS DE LATEX

Molinari J.,1 Medrano A.,2 Monsalve L.,2 Ybarra G.1
(1) INTI Procesos Superficiales; (2) INTI-CMNB
molinari@inti.gob.ar

Introducción
La alergia alimentaria es un problema mundial
que impacta en la seguridad alimentaria y en la
salud publica. Las proteínas de la leche de
vaca son una de las principales causas de
alergia alimentaria en niños menores de tres
años, con una prevalencia en la población
general que varía entre 2 y 3 %. Suele
desarrollarse en las primeras semanas
posteriores a su introducción en la dieta y en
niños que están siendo alimentados con leche
materna debido al consumo de leche de vaca
por parte de la madre o al uso de fórmulas de
leche infantiles que contienen las proteínas
completas. La mayoría de los pacientes están
sensibilizados a varias proteínas. Caseína, β-
lactoglobulina y α-lactoalbumina son los
mayores alérgenos y los más abundantes en la
leche de vaca. Más del 50% de los individuos
alérgicos a la leche de vaca están
sensibilizados a estas proteínas (65%, 61% y
51% respectivamente).
Hay varias técnicas analíticas para la detección
de estas proteínas. ELISA es el método más
comúnmente usado en la industria alimentaria
debido a su alta precisión, bajo límite de
detección y alta especificidad, pero requiere
una instrumentación y reactivos costosos. Los
biosensores, dispositivos compactos que
utilizan moléculas de reconocimiento
específicas para los analitos de interés y
combinan una electrónica integrada, son una
alternativa económica a las técnicas
disponibles en el mercado. Aunque en el
campo de los biosensores en los últimos años
se han generados muchos trabajos, el uso de
biosensores electroquímicos para la detección
y cuantificación de alérgenos en alimentos es
escasos.

Objetivo
Desarrollar un método alternativo innovador,
económico y de producción nacional para la
detección y cuantificación de alérgenos en
alimentos. Este proyecto en desarrollo se basó
en la cuantificación de β-lactoglobulina, una
proteína altamente alergénica de la leche.

Descripción
El dispositivo consiste en un biosensor
electroquímico amperométrico formado por una
instrumentación electrónica, llamado
potenciostato y por electrodos de carbono que
se conectan al equipo. El principio de detección
está basado en un inmunoensayo de captura
empleando anticuerpos inmovilizados
covalentemente a la superficie de los
electrodos. Sobre el electrodo ocurre el
reconocimiento del alérgeno de la muestra. Un
segundo anticuerpo conjugado a la enzima
peroxidasa de rabano picante (HRP) se une a
un epitope libre del alergeno del complejo
antígeno-anticuerpo unido al electrodo. La
medida electroquímica de la actividad
enzimática de la HRP luego de la adición de
peroxido de hidrogeno, un mediador rédox y la
aplicación de un potencial al electrodo, es una
corriente eléctrica procesada por un
potenciostato portable conectado a una PC vía
puerto USB. La señal eléctrica es proporcional
a la cantidad de alérgeno permitiendo su
cuantificación a través de una curva estándar
de calibración. Los electrodos de carbono de
trabajo y contraelectrodo fueron impresos
mediante la tecnología de película gruesa y
luego integrados en una celda electroquímica
acrílica Como electrodo de referencia se
empleó Ag|AgCl|0.1 M KCl. Los anticuerpos
son moléculas complejas cuyos sitios de
reconocimiento deben estar expuestos sobre la
superficie de los electrodos de carbono para
unirse a su antígeno específico. Los
anticuerpos se inmovilizaron por la reaccion de
carbodiimida entre los grupos amino primarios
del anticuerpo y los grupos carboxilos ubicados
sobre partículas de latex inmersas en la tinta de
nanotubos de carbono. Con dicha tinta se
pintaron los electrodos de trabajo de las celdas
elctroquímicas. Los parámetros del
inmunoensayo y condiciones de medición
fueron optimizados.

Figura 1: Representación esquemática de la interacción
antígeno-anticuerpo sobre el electrodo de carbono
después del inmunoensayo captura y detección
electroquímica por el mediador rédox (hidroquinona,
H2Q, y 1,4-benzoquinona, BQ).








Figura 2: Impresión serigráfica de los electrodos de
trabajo y contraelectrodos.



Resultados








Figura 3: Imagen SEM de electrodo de trabajo pintado
con tinta de nanotubos de carbono y particulas de latex
funcionalizadas con grupos carboxilos.

Bajo el método desarrollado, la concentración
de β-lactoglobulina esta directamente
relacionada a la medida de la corriente
generada como se muestra en la Fig. 4.
Las óptimas condiciones del sistema fueron
encontradas para obtener un rango de
cuantificación de 0.02 ppm hasta 20 ppm. Los
parámetros optimizados fueron las
concentraciones de anticuerpos primario
inmovilizado y anticuerpo conjugado, así como
los tiempos de incubación. El rango de
medición es útil para el control de alérgenos en
alimentos y la portabilidad del equipo
representa una importante ventaja con respecto
a los métodos comerciales disponibles en el
mercado.














Figura 4. Curva corriente vs concentración. La corriente fue
medida a los 60 s de aplicar un potencial de -280 mV con
una concentracion de H2O2 de 1.5 mM usando diferentes
concentraciones de β-lactoglobulina en la muestra.

Conclusiones
La determinación de alérgenos en alimentos es
un tema de creciente preocupación. El
desarrollo de un biosensor electroquímico
amperométrico asociado a un inmunoensayo
de captura presentado en este trabajo para la
cuantificación de β-lactoglobulina tiene varias
ventajas. El uso de tintas con nanotubos de
carbono y partículas de latex funcionalizadas
con grupos carboxilos ha permitido inmovilizar
covalentemente los anticuerpos anti β-
lactoglobulina utilizados en el inmunoensayo en
cantidad suficiente y con sus sitios de
reconocimento expuestos en la superficie del
electrodo como para lograr la sensibilidad
adecuada para la cuantificación del alérgeno.
Dicha inmovilización no fue efectiva cuando se
generaron sobre la superficie del electrodo de
carbono grupos carboxilos mediante el
tratamiento con plasma. En ese caso, el
número de grupos formados fue insuficiente
para inmovilizar el número de anticuerpos
necesarios para generar la adecuada
sensibilidad en el inmunoensayo.
No hay actualmente en la legislación de ningún
país, a excepción de Japón, que establezca un
límite de alérgenos en alimentos, pero
generalmente se considera que trazas de
alergenos puede conducir a reacciones
alérgicas. En Japón este límite se estableció en
10 ppm, en tanto que el límite de detección
logrado en este ensayo es del orden de 0.02
ppm.

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Agradecimientos: A Paulina Lloret y Lionel Veiga por las
imágenes SEM.