NANOVEHÍCULOS DEL ÁCIDO 5-AMINOLEVULÍNICO (ALA)
EN EL TRATAMIENTO FOTODINÁMICO DEL CÁNCER
J. Morrone (1), R. Gauna (1), V. Zannoni (1), G. Gola (2), G. Di Venosa(3), J. A. Ramírez (2), A. Casas(3), V.Defain(1)
(1) INTI Química, (2) Departamento de Química Orgánica de la FCEN, UBA, (3) Centro de Investigación sobre Porfirinas y
Porfirias, CIPYP-CONICET
mvdt@inti.gob.ar

Introducción
La luz puede ser empleada para el tratamiento
de tumores superficiales o de acceso por vía
endoscópica por medio de la Terapia
Fotodinámica (TFD). Se basa en el uso de
fotosensibilizantes que al ser expuestos a la luz
dan lugar a una serie de reacciones
fotoquímicas. De esta manera, pueden
destruirse selectivamente las células
fotosensibilizadas.
Un fotosensibilizante endógeno importante es
la Protoporfirina IX (PpIX), que se biosintetiza a
partir de su precursor, el ácido 5-
aminolevulínico (ALA). La administración de
ALA en un tejido particular lleva a la
acumulación de porfirinas, que en general es
más pronunciada en células con alta actividad
metabólica, tales como células tumorales.
A) B)







Figura 1. A) Estructura del ALA. B) Estructura de la
Protoporfirina IX

A pesar de que el uso de ALA en TFD ha
mostrado un gran potencial para tratamientos
de células tumorales su eficacia se ve limitada
por su naturaleza altamente hidrofílica, lo que
lleva a una baja penetración en tejidos
malignos. A pH fisiológico, el ALA es un
zwitterión, lo cual limita su capacidad para
atravesar las membranas celulares vía difusión
pasiva, y puede resultar en una baja
penetración y una distribución en los tejidos
blanco no homogénea.

Objetivo
Sintetizar compuestos derivados del ALA
mediante reacciones multicomponentes
aumentando su lipofilicidad y
nanovehiculizarlos para mejorar su penetración
en tejidos malignos blanco.

Descripción
Síntesis de derivados de ALA (dALA)
El Esquema 1 muestra como el ALA, con el
grupo amino protegido, participa de una
reacción de Passerini de 3 componentes (P-
3CR) para generar un intermediario cuya
posterior hidrogenación produce el derivado
buscado. El componente carbonílico empleado
en la P-3CR es formaldehído, cuya alta
reactividad evita que el grupo ceto del ALA
interfiera en la reacción, y al mismo tiempo
forma el enlace éster requerido.
H H
O
R1 N C N
H
O
OH
O
Cbz P-3CR N
H
O
O
O H
N
O
R1
Cbz
H2N
O
O
O H
N
O
R1
+ +
Ester
desprotección
1

Esquema 1. Reacciones de Passerini con posterior
desprotección para la síntesis de derivados de ALA

Mediante esta secuencia se pudo preparar una
familia de derivados con distintos sustituyentes
R1, que fueron evaluados in vitro para estudiar
su actividad como prodrogas de ALA. En la
Tabla 1 figuran los compuestos obtenidos.
Todos promovieron la biosíntesis de
protopofirina. Entre ellos se destaca el
compuesto 2-((4-fluorofenil) amino)-2-oxoetil-5-
aminolevulinato (1P). Los compuestos se
caracterizaron por 1H-RMN y 13C-RMN, y EM
de alta resolución.
Tabla 1: Compuestos dALA sintetizados.
Compuesto Log D Estructura
p-
fluorofenil-
ALA (1P)
-0,36

Ciclohexil-
ALA
(2P)
-0,72

ALA -3,37

Nota: Log D es el coeficiente de distribución

Preparación de los nanovehículos
Se evaluó la preparación de dos tipos de
nanovehículos: Carriers lipídicos
nanoestructurados (NLC) y liposomas
ultradeformables (LUDs).
Para la preparación de NLC, se estudió la
solubilidad de los compuestos obtenidos en
diferentes lípidos, entre ellos, ácido láurico,
alcohol cetílitico, ácido oleico y oleato de
glicerilo. No se logró solubilizar ningún derivado
de ALA en los lípidos disponibles. En
consecuencia, se propuso la encapsulación de
estos derivados de ALA en LUDs.

Los LUDs fueron preparados de acuerdo al
método de hidratación de la película delgada
empleando fosfatidilcolina de soja y colato de
sodio. Se hidrataron con solución 60 mM de
cada derivado de ALA en NaCl 0.9% p/v, con
agitación magnética. Los liposomas
multilamelares resultantes se extruyeron a
través de membranas de poro definido de 0,1
µm. Dicha extrusión se realizó con un extrusor
manual. De la misma manera se prepararon
LUDs sin derivados (LUDs Blanco) como
control. Los LUDs cargados se separaron de la
droga libre por columna de exclusión molecular
con Sephadex® G-50 medium.
Caracterización fisicoquímica de los LUDs
Las suspensiones de LUDs obtenidas se
caracterizaron mediante la distribución de
tamaño de partícula (Z-Ave) y el índice de
polidispersidad (PdI) por dispersión dinámica
de luz. El potencial Z se determinó por análisis
en fase de scattering de luz (PALS, del inglés
phaseanalysis light scattering). Para la
determinación de la concentración de LUDs en
los eluatos de la columna se realizó la
cuantificación de fosfatos mediante la reacción
colorimétrica de Böttcher. La eficiencia de
encapsulación (%EEp/p) se determinó en las
fracciones eluídas que contenían fosfolípidos
por cuantificación del ALA y los derivados del
ALA mediante la reacción colorimétrica de
Ehrlich.
Evaluación in vitro de los LUDs
La producción de porfirinas se evaluó
empleando como modelo la línea celular de
adenocarcinoma mamario murino (LM2). Se
incubaron las células con los distintos
compuestos, y al cabo de 3 h se realizó la
extracción y cuantificación de porfirinas por
extracción en HCl 5%. Luego se cuantificó
fluorométricamente (excitación: 406 nm;
emisión: 604 nm). Se utilizó PpIX (Porphyrin
Products, Logan, Utah, USA) como estándar de
referencia.

Resultados
Como puede observarse en la Tabla 2, la
distribución de tamaño de partícula de los
LUDs obtenidos fue la esperada, con un
diámetro medio (ZAve) menor a 120 nm en
todos los casos y un índice de polidispersidad
(PDI) menor a 0,2. Mientras que el potencial Z
cercano a 0 mV se correlaciona con una baja
estabilidad física de los LUDs en suspensión.
El compuesto 1 P presenta la mayor eficiencia
de encapsulación (%EE) que se correlaciona
con su mayor lipofilicidad (mayor log D)
permitiendo su mayor retención en la bicapa
lipídica (Tabla 2).

Tabla 2: Caracterización fisicoquímica de los
LUDs
LUDs [Fosfato]
mM
%EE
p/p
Z-Ave
nm
PdI Pot ZmV
LUDs
blanco 45,8 - 114 (1)
0,152
(0,014)
-24
(6)
LUDs
ALA 2,4 4,5 91 (2)
0,118
(0,003) -4 (5)
LUDs
1P 8,6 6,9 120 (2)
0,084
(0,013) -3 (5)
LUDs
2P 6,8 2,7 106 (2)
0,149
(0,008) -4 (6)
Nota: Los resultados indicados entre paréntesis
corresponden al desvió estándar de la medición.

En la tabla 3, se observan los resultados de
producción de porfirinas obtenidos en la
evaluación in vitro tanto de ALA como de los
dALA. La viabilidad por MTT fue de 100% para
1P-ALA LUDs, 2P-ALA LUDs y ALA-LUDs a la
concentración más alta (0.6 mM). La
producción de porfirinas fue mayor en los
estudios con ALA y sus dALA libres que en los
LUDs. Esto podría deberse a una inducción en
la liberación de las porfirinas al medio extra
celular producto del alto contenido lipídico en el
citoplasma o por una liberación deficiente del
contenido de los LUDs.
Tabla 3: Evaluación in vitro de los LUDs
[mM]
ALA
dALA
ALA
libre
2P
libre
1P
libre
LUDs
ALA
LUDs
2P
LUDs
1P
0 20 20 20 19 20 21
0,1 53 83 61 49 49 53
0,3 78 72 76 48 55 47
0,6 77 73 73 45 48 49

Conclusiones
En este trabajo se lograron sintetizar dos
derivados de ALA mediante una reacción de
Passerini seguida de hidrogenación. Estos
derivados fueron obtenidos mediante el
desarrollo de una nueva ruta de síntesis
partiendo de ácido levulínico. Los derivados
obtenidos se pudieron encapsular en LUDs.
Dado que en la línea celular estudiada con
LUDs hubo menor producción de porfirinas se
evaluará en otras líneas celulares. Además, se
emplearán modelos in vivo para estudiar la
permeación transdérmica.
En futuros abordajes experimentales se
probarán nuevos derivados de ALA con mayor
liposolubilidad para ser vehiculizados en NLC
con el objeto de desarrollar formulaciones de
aplicación tópica.
Bibliografía
M. Kaliszewski et al. Biological activity of 5-aminolevulinic
acid and its metil ester alter storage under different
conditions, Journal of Photochemistry and Photobiology B:
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Q. Peng, T. Warloe, J. Moan, H. Heyerdahl, H. B. Steen, J.
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