INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA INDUSTRIAL 1

Estudios de absorción de hierro en liposomas mediante cultivos
celulares

Hermida, L.(i); Dománico, R.(i); Sabés, M.(ii); Barnadas, R.(ii)

(i) INTI-Química
(ii) Unidad de Biofísica – Universidad Autónoma de Barcelona - España

Introducción
La anemia por deficiencia de hierro es un problema
difundido alrededor del mundo, fundamentalmente
en los países en vías de desarrollo, en los que
afecta a un alto porcentaje de la población.
Los estudios de absorción de hierro son
fundamentales a la hora de evaluar la eficacia de
una formulación y los modelos propuestos para
evaluarla son numerosos: estudios de solubilidad,
modelos aritméticos, estudios en animales, en
humanos y estudios de absorción con cultivos
celulares [1].
Los cultivos de células Caco-2 se han empleado
para estudios de absorción de hierro desde
principios de los 90. Esta línea celular, proveniente
de carcinoma de colon humano, se diferencia
espontáneamente exhibiendo muchas de las
características de las células del epitelio intestinal
humano. De esta forma, los resultados obtenidos
tienen una buena correlación con las medidas de
absorción en humanos para diversas
combinaciones de alimentos [2].
El objetivo de este trabajo consistió en la
evaluación de la absorción de hierro mediante
cultivos de Caco-2, después de incubaciones con
sulfato ferroso incorporado a liposomas de distinta
composición, antes o después de procesos de
digestión simulada. La idea fue evaluar su
potencial como sistemas de liberación controlada
para administración por vía oral.
Metodología
Preparación de liposomas:
Se emplearon materias primas grado alimenticio y
procesos transferibles a escala industrial.
Se prepararon tres modelos de liposomas con
distinta composición lipídica:
—Fosfatidilcolina de soja (SPC)
—Fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC)
—HSPC – colesterol (3:2) molar (HSPC-chol).
En todos los casos se incorporó hierro a una
concentración de 0,24M como sulfato ferroso
heptahidrato, estabilizado con ácido ascórbico en
relación 1:2 molar.
Los liposomas fueron preparados mediante
homogeneización de alta presión, empleando un
equipo Microfluidizer 110S escala laboratorio,
operando por ciclos [3].
Digestión simulada de liposomas
Los liposomas conteniendo hierro – ácido ascórbico
(FeAA) se separaron del hierro no encapsulado por
cromatografía de exclusión molecular. Luego, se
sometieron a un proceso de digestión simulada
adaptado de la bibliografía [4]:


Liposomas con FeAA encapsulado

Incubación con pepsina a pH 2,0 1h a 37ºC

Incubación con pancreatina y sales biliares
a pH 6,5 1h a 37ºC

Dilución en buffer de incubación pH 7,4
(Concentración hierro = 100µM)


Cultivos celulares
Se emplearon células Caco-2 provenientes de la
European Collection of Cell Cultures (ECCC) que
fueron cultivadas según bibliografía [5]. El ensayo
con liposomas se realizó entre los 12 y 15 días
después de la siembra, habiéndose verificado la
confluencia entre ellas.
Incubación de células con liposomas
Las células se incubaron 1h a 37ºC con las
distintas formulaciones, sometidas o no a la
digestión simulada. Como blanco se emplearon
células incubadas con buffer de incubación pH 7,4
y como referencia, células incubadas con una
solución de FeAA.
Las especies insolubles de hierro adsorbidas sobre
las células, fueron lavadas con un reactivo

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Blanco PC1 FeAA SPC HSPC HSPC-chol
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
PRE digestión
POST digestión
µg

Fe
/
m
g
pr
o
t
específico (batofenantrolina) que forma un
complejo con el hierro [5].
Análisis de hierro por absorción atómica
Las células lavadas fueron suspendidas en tritón X-100
al 2% y luego sometidas a ultrasonido hasta obtener
extractos homogéneos que fueron analizados por
absorción atómica en horno de grafito.
Determinación de proteínas
El contenido de proteínas en los extractos celulares se
determinó por el método BCA (BioRad), calibrando con
albúmina de suero bovino.
Microscopía confocal
Se prepararon liposomas de HSPC-chol incorporando
una sonda fluorescente (HPTS) y se incubaron con
células Caco-2 1h a 37ºC. Una vez lavadas, se evaluó
mediante microscopía confocal la presencia de la sonda
en el interior celular.
Resultados
En la Figura 1 se muestran los niveles de hierro
incorporados a células incubadas con liposomas de
distinta composición antes o después de ser sometidos
al proceso de digestión simulada.


















Fig. 1: Determinación del contenido de hierro en extractos celulares
incubados con liposomas o hierro soluble pre y postdigestión. Los
resultados se expresan como µg Fe / mg de proteína y son el promedio
de al menos dos replicados independientes (n=3 para cada ensayo
independiente). PC1: producto comercial Nº1.

Con respecto a los resultados predigestión, únicamente
la formulación HSPC-Chol resulta tan efectiva como la
solución de FeAA.
Por el contrario, los liposomas digeridos muestran
aumentos significativos en la captación celular de
hierro respecto a la solución de FeAA y al producto
comercial (PC1) digeridos.
La Figura 2 muestra fotografías obtenidas mediante
microscopía confocal, de células incubadas
previamente con liposomas de HSPC-chol sin digerir. Se
observa una clara distribución de la fluorescencia
asociada a las células.
















Fig. 2: Fotografías de células Caco-2 incubadas 1h a 37ºC con liposomas
HSPC-Chol conteniendo HPTS. En la fotografía izquierda se muestra la
fluorescencia debida a la sonda HPTS y en la derecha la superposición de
ésta con una microfotografía de las células Caco-2.

Conclusiones
El trabajo realizado permite inferir que el hierro
incorporado a estos tres modelos de liposomas es
absorbido por células Caco-2, ya que en todos los
casos los valores obtenidos superan el nivel
basal.
Para liposomas sin digerir, sólo las células
incubadas con HSPC-chol muestran niveles
comparables al control de FeAA sin liposomar.
Por el contrario, en el caso de las formulaciones
digeridas, las células incubadas con liposomas
tienen contenidos de hierro significativamente
superiores a la referencia (FeAA) y al producto
comercial evaluado (comprimidos de sulfato
ferroso con cubierta entérica).
Se observa además, que en el caso de todas las
formulaciones de liposomas digeridas, la
absorción de hierro por las células es superior a
la obtenida cuando las formulaciones no se
digieren. Estos resultados sugieren que el
proceso digestivo favorece la biodisponibilidad del
hierro encapsulado en liposomas, hecho que no
tiene lugar en el caso del hierro soluble (FeAA).
Referencias
[1] Fairweather-Tait S.J. ”Iron”. J. Nutr. 131:1383-1386 (2001).
[2] Au A., Reddy M. S. “Caco-2 cells can be used to assess human
iron bioavailabilty from a semipurified meal”. J. Nutr. 130:1329-
1334 (2000).
[3] Barnadas R. y Sabés M. “Liposomes prepared by high-
pressure homogeneizers”. Methods in enzymology, Vol.367:28-46
(2003).
[4] García M., Flowers C., Cook J. “The Caco-2 cell culture system
can be used as a model to study food iron availability”. J. Nutr.
126:251-258 (1996).
[5] Glahn R., Gangloff M.B., van Campen D.R., Miller D.D., Wien
E.M., Norvell W.A. “Bathophenanthrolene disulfonic acid and
sodium dithionite effectively remove surface-bound iron from
Caco-2 cell monolayers.” J. Nutr. 125:1833-1840 (1995).


Para mayor información contactarse con:
Laura Hermida – lhermida@inti.gov.ar