INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA INDUSTRIAL 1

Purificación de bacteriocinas producidas por lactobacillus curvatus
CRL705 para su uso en envases de productos cárnicos

Blanco Massani, M.(i); Epifane, M.E.(i)

(i)INTI-Plásticos - CERELA-CONICET
(ii)INTI-Carnes
Introducción
Las bacteriocinas son sustancias antimicrobianas
producidas por numerosas especies de bacterias
lácticas con capacidad inhibitoria frente a
microorganismos contaminantes y patógenos de
alimentos incluyendo Clostridium perfringes,
Staphylococcus aureus, Brochothrix
thermosphacta. y Listeria monocytogenes. Estos
metabolitos naturales usados como una barrera
adicional en la biopreservación de productos
cárnicos podrían reemplazar la adición de
antimicrobianos como los ácidos orgánicos y sus
sales.
Las bacteriocinas son péptidos catiónicos,
hidrofóbicos y difieren ampliamente en
características tales como peso molecular,
presencia de ciertos amino ácidos (aa), punto
isoeléctrico (pI) y modificaciones post-
traslacionales de algunos aa.
Esta heterogeneidad dentro de las bacteriocinas
justifica los diferentes procesos desarrollados para
su purificación, los que incluyen la precipitación de
proteínas mediante sales seguido de filtración en
gel, cromatografía de intercambio iónico y HPLC
entre otros.
En este trabajo se diseñaron estrategias con el fin
de purificar dos bacteriocinas catiónicas producidas
por Lactobacillus curvatus CRL705, lactocina 705 y
lactocina AL705, activas frente a Lactobacillus
plantarum CRL691 y Listeria innocua 7,
respectivamente.
La precipitación con sulfato de amonio fue la etapa
inicial y luego se realizó:
1) extracción orgánica con isopropanol,
2) cromatografía en fase sólida usando
columnas C18 y elución con soluciones de
isopropanol y acetato de amonio 200mM.
Por otro lado las bacteriocinas parcialmente
purificadas se incorporaron mediante
inmersión (soaking) en filmes destinados al
envasado de salchichas a fin de obtener filmes
activos antimicrobianos.

Metodología / Descripción Experimental
Microorganismos y condiciones de cultivo.
L. curvatus CRL705, productor de lactocina 705 y
lactocina AL705 y L. plantarum CRL691 usado
como indicador de lactocina 705, fueron aislados
de embutidos artesanales Argentinos [4] L.
curvatus CRL1579, obtenido a partir de L. curvatus
CRL705 es productor de lactocina AL705
(compuesto antilisteria). Las cepas de Bl fueron
cultivadas en MRS a 30ºC. Listeria innocua 7,
indicador de lactocina AL705 (cedida por La Unité
de Recherches Laitiéres et Génitique Appliqueé,
Francia) fue cultivada en caldo TSB + extracto de
levadura al 0.5% a 30ºC.
Obtención de bacteriocinas.
El cultivo libre de células de L. curvatus CRL705 se
precipitó con sulfato de amonio (44%) como etapa
inicial en todas las estrategias ensayadas. (1)
Extracción con isopropanol: luego de la saturación
con NaCl; se realizaron tres extracciones con
isopropanol (1/4 del volumen inicial de la solución)
[2]
. (2) Cromatografía en fase sólida: se usó una
columna C18[1] y como eluyentes 4 volumenes de
acetato de amonio (200mM) + isopropanol al 10,
30, 40, 50 y 100%.
Los residuos de isopropanol fueron descartados en
frascos de vidrio y almacenados en sala de
residuos peligrosos hasta su posterior recolección.
Cuantificación de la actividad antimicrobiana
y dosaje de proteínas.
La actividad antimicrobiana se determinó por el
método de difusión en agar[3] usando como
organismos sensibles L. plantarum CRL 691 y L.
innocua.7 La concentración proteica se estableció
mediante el método de Bradford.

INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA INDUSTRIAL 2

Obtención de filmes activos antimicrobianos.
Filmes multicapa de cara interna de polietileno se
sumergieron durante 1 hora en las soluciones de
bacteriocinas parcialmente purificadas. Luego de la
incorporación, se lavaron con agua destilada
estéril, se secaron a 50°C durante 10 minutos y se
ensayaron frente a los microorganismos sensibles.
Se realizaron controles negativos sumergiendo los
filmes en isopropanol durante 1 hora.

Resultados
Purificación de las bacteriocinas
Si comparamos el porcentaje de proteínas
eliminado respecto a la solución inicial para las
distintas estrategias de purificación, se observa
que por el método (2) se alcanza mayor
pureza. (ver Fig 1)
.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2
% de proteinas
eliminados

Fig. 1: Porcentaje de proteínas eliminadas respecto
a la solución inicial. (1) Extracción con isopropanol.
(2) Extracción en fase sólida

AL comparar las actividades relativas de las
bacteriocinas parcialmente purificadas, se observa
que en la extracción con isopropanol se obtiene
una mayor actividad inhibitoria respecto a la
extracción en fase sólida (ver Fig 2).

Fig. 2: Actividad relativa (fracción purificada/fracción
inicial) de las fracciones obtenidas mediante las distintas
estrategias de purificación. (1) Extracción con
isopropanol, (2) Extracción en fase sólida.
Obtención de filmes activos antimicrobianos
Luego de sumergir un filme de cara interna de
polietileno en la solución obtenida por (1) y lavarlo
con agua, este presenta actividad antimicrobiana
frente a L.innocua7 (ver Fig 3) y L.plantarum
CRL691(ver Fig 4 ). No ocurre lo mismo para la
solución activa obtenida por el método (2). Los
controles negativos no presentaron actividad.

Fig. 3: Filmes tratados con la solución de bacteriocinas
parcialmente purificada obtenida por extracción con
isopropanol ensayados frente a L.innocua7.



Fig. 4: Filmes tratados con la solución de bacteriocinas
parcialmente purificada obtenida por extracción con
isopropanol ensayados frente a L.plantarum CRL691.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1 2
lactocina 705
lactocina AL705

INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA INDUSTRIAL 3

Conclusiones
Las sucesivas diluciones que se producen cuando
se realiza extracción en fase sólida como método
de purificación son las responsables de la
disminución de la actividad antimicrobiana en el
mismo, debido a la cual no se puede obtener un
filme antimicrobiano por inmersión. En el caso de
la extracción con isopropanol, además de la mayor
actividad antimicrobiana obtenida, este método es
simple y fácil de llevar a cabo, por ello fue elegido
para la purificación parcial de las bacteriocinas. Si
bien el isopropanol resulta nocivo en caso de
ingestión o inhalación; en el proceso de desarrollo
del filme antimicrobiano existe una etapa de
lavado con agua y un posterior secado, con lo que
se aseguraría la eliminación casi total del mismo.
No obstante, este compuesto se encuentra en la
lista positiva de aditivos para materiales plásticos
destinados a la elaboración de envases en contacto
con alimentos sin límite de restricción. [5]
La posibilidad de obtener envases con actividad
antimicrobiana a partir de filmes para productos
cárnicos permitiría evitar el deterioro del alimento
debido a contaminaciones post-proceso.
Referencias
1. Berjeaud Jean-Marc and Cenatiempo Yves.
Purification of Antilisterial Bacteriocins. Methods in Molecular
Biology, vol. 268: Public Health Microbiology: Methods and
Protocols.
2. Burianek, L.L.and, Yousef, A.E. (2000) Solvent
extraction of bacteriocins from liquid cultures. Letters in
Applied Microbiology. 31, 193-197
3. Nielsen, J.W., Dickson, J.S., and Crouse, J.D.
Use of a Bacteriocin Produced by Pediococcus acidilactici To
Inhibit Listeria monocytogenes Associated with Fresh Meat.
Applied and Environmental Microbiology. 56,7. 2142-2145
4. Vignolo, G., Suriani F., R. Holgado, A y Oliver, G.
(1993) Antibacterial activity of Lactobacillus strains isolated
from dry fermented sausages. J. Appl. Bacteriol. . 75, 344-
349.
5. Resolución MERCOSUR Nº 50/01. LISTA POSITIVA DE
ADITIVOS PARA MATERIALES PLÁSTICOS DESTINADOS A LA
ELABORACIÓN DE ENVASES Y EQUIPAMIENTOS EN CONTACTO
CON ALIMENTOS (MODIFICACIÓN DE LA RES. GMC Nº 95/94).