COMPARACIÓN DE MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE EFECTIVIDAD
ANTIMICROBIANA EN PELÍCULAS PLÁSTICAS

Cancela E1, Matos L1, Fiszman G1, Eisenberg P2, Blanco Massani M2*
(1) INTI Biotecnología Industrial (2) INTI Plásticos,
*blanco@inti.gob.ar
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO
Mientras la investigación avanza en el campo
de los materiales activos, muchos polímeros
con actividad antimicrobiana muestran
aplicaciones comerciales promisorias; sin
embargo, la metodología para evaluar su
efectividad es muy variada, resultando difícil
llevar a cabo análisis comparativos unificados.
Si bien existen métodos cuantitativos
normalizados, su aplicación en la
determinación de la actividad antimicrobiana
resulta compleja cuando se requieren ensayar
muchas películas simultáneamente. En
contraste, los métodos semi-cuantitativos más
sencillos ofrecen resultados subjetivos.
En este trabajo se analizaron dos estrategias
metodológicas con el fin de determinar la
actividad antimicrobiana en plásticos. Para ello,
se evaluaron películas plásticas
antimicrobianas utilizando un método de
difusión y uno de recuento en placa
(adaptación de la norma ASTM E2149).
DESCRIPCIÓN
Muestras plásticas
Se ensayaron dos películas de polietileno, la
película P, adicionada con un agente biocida
(mineral de silicio modificado con ión plata
(Ag+)) y la película L (un control sin actividad
antimicrobiana). En ambos casos las muestras
se procesaron cortando discos de un diámetro
de 0,5 mm. Todas las muestras fueron
esterilizadas de ambos lados con luz UV (15’
cada lado) (Philips germicida 15W) y se
mantuvieron en condiciones estériles hasta el
momento de su uso.
Microorganismos
-Staphylococcus aureus (ATCC 25923) como
representante del grupo de las bacterias Gram
positivas.
-Escherichia coli (ATCC 25922) como
representante del grupo de las bacterias Gram
negativas.
Evaluación de la actividad antimicrobiana
en plásticos
Método cualitativo. Se utilizó el método de
difusión en agar [1]. Se sembraron placas de
medio mínimo Luria Bertani (LB) (Britania) agar
semisólido con 100 μl de cultivos overnight de
los microorganismos previamente
mencionados. Sobre la superficie de las placas
se colocaron los discos correspondientes a
cada una de las muestras a evaluar. Se incluyó
un disco (C) impregnado con cloranfenicol (50
μg/disco) como control positivo de inhibición.
Luego de incubar las placas durante 20 h a 36
± 2 °C en estufa se evaluó la aparición de halos
de inhibición del crecimiento bacteriano.
El ensayo fue realizado en dos experimentos
independientes por triplicado.
Método cuantitativo. El procedimiento
utilizado se basó en la norma ASTM E2149 [2]
con algunas modificaciones. S. aureus ATCC
25923 y E. coli ATCC 25922 se cultivaron por
separado (18 hs a 28ºC) y se formularon
inóculos iniciales de 105 unidades formadoras
de colonias por mililitro (UFC/ml) en solución
fisiológica. El inóculo inicial de cada
microorganismo fue incubado a temperatura
ambiente y en agitación con 5 discos de cada
una de las muestras plásticas (P y L),
manteniendo la relación área de
muestra/inóculo (25.8 cm2/105 UFC/ml)
referenciada en la norma ASTM E2149. Luego
de 1 hora de incubación se realizaron los
plaqueos para llevar a cabo el recuento de
colonias correspondiente a la muestra activa
(P) y el control sin agente biocida (L). Los
resultados se compararon e informaron como
reducción del crecimiento de las variables
transformadas logarítmicamente.
Tratamiento estadístico.
Los valores de recuento se informaron como
log10 ± la incertidumbre asociada al método de
recuento de colonias. El cálculo de
incertidumbre se llevó a cabo sobre las
variables transformadas logarítmicamente
(log10 UFC/ml) según la ecuación 1
(1) RSU 2
Siendo SR la desviación de reproducibilidad
obtenida como el promedio de las diferencias
cuadráticas de resultados entre series de
placas inoculadas en condiciones de
reproducibilidad [3]. La incertidumbre
expandida para cada microorganismo resulta:
U (S. aureus) = 0,28 log10 UFC/ml
U (E. coli) = 0.21 log 10 UFC/ml
La comparación entre pares se realizó por la
prueba T, utilizando el Software libre para
análisis estadístico PaSt [4]
RESULTADOS
Los resultados de la evaluación de la actividad
antimicrobiana en plástico utilizando el método
cualitativo se muestran en la Figura 1. Se
observó la presencia de áreas oscuras (sin
crecimiento) en las placas sembradas con S.
aureus ATCC 25923 tanto para el disco C
conteniendo cloranfenicol como para la película

P (Fig. 1a), mientras que no se observó
inhibición debida a la película L (sin
antimicrobiano). Ninguna de las películas
plásticas ensayadas presentó inhibición frente
a E. coli ATCC 25922, obteniéndose actividad
antimicrobiana solo para el control con
cloranfenicol (Fig. 1b).

Figura 1. Evaluación de la actividad antimicrobiana por
el método cualitativo frente a (a) S. aureus ATCC 25923
(b) E. coli ATCC 25922. C: disco con Cloranfenicol (50
μg/disco); L: película plástica; P: película plástica con
agente biocida.
Los métodos de determinación de actividad
antimicrobiana a través de la evaluación de
zonas de inhibición involucran la difusión del
agente antimicrobiano en el medio de cultivo a
partir de un sustrato, y la inhibición del
crecimiento por la presencia del antimicrobiano
en una concentración que excede la
concentración mínima inhibitoria (CIM) para
ese antimicrobiano frente al microorganismo
sensible [5]. Los resultados obtenidos por el
método de difusión en agar sugieren que el
agente antimicrobiano presente en el plástico
activo (P) se encontraría por debajo de la CIM
necesaria para inhibir el crecimiento de E. coli
ATCC 25922, resultando sólo efectivo frente a
S. aureus ATCC 25923.
El método cuantitativo basado en la norma
ASTM E2149 permitió cuantificar la viabilidad
de los microorganismos luego de estar en
contacto con las películas plásticas. Para el
recuento de S. aureus ATCC 25923 se
observaron diferencias significativas (P<0,05)
cuando la bacteria se incubó en presencia de la
película activa (P) respecto al control sin
agente biocida (L), obteniéndose una reducción
del crecimiento de 3,19 unidades logarítmicas
(Tabla 1). Para E. coli ATCC 25922, en cambio,
no se observaron diferencias significativas
(P≥0,05) en el recuento obtenido en presencia
de la película activa y el control sin agente
biocida (Tabla 1).
Tabla 1. Recuento de microorganismos luego de ser
incubados en presencia de las películas plásticas.
Microorganismo
sensible
Recuento bacteriano (log10
UFC/ml)
Película P Película L
S. aureus ATCC 25923 3.19 ± 0,28a -*
E. coli ATCC 25922 3.82 ± 0.21b 3.90 ± 0.21b
* Recuento menor que 30 UFC/ml
a-b letras diferentes indican diferencias significativas entre
valores (P<0,05)
Estos resultados están de acuerdo con los
obtenidos mediante el método cualitativo,
confirmando que la cantidad de biocida
presente en el plástico resultaría eficiente para
la inhibición de S. aureus e insuficiente para
inhibir el crecimiento de E. coli. La diferencia en
la suceptibilidad al agente activo podría estar
relacionada con la estructura diferencial entre
la pared celular de Gram negativas respecto a
las Gram positivas. El método cuantitativo
además, podría utilizarse para determinar el
efecto del tiempo de exposición del
microorganismo al agente antimicrobiano
presente en el plástico. Asimismo, dado que el
método cuantitativo permitió evaluar la
reducción en la viabilidad de los
microorganismos expuestos al agente
antimicrobiano, consideramos a éste como el
método más apropiado para la evaluación de
efectividad de matrices plásticas aditivadas con
agentes biocidas.
Por otro lado, el método cualitativo permitió
evaluar de forma rápida y sencilla la presencia
o ausencia de actividad biocida en un plástico
por la presencia o ausencia de inhibición del
crecimiento del microorganismo sensible, esto
permitiría utilizar el método para controles de
calidad de plásticos activos rápidos.
Conclusión
El presente trabajo permitió poner a punto un
método cualitativo y uno cuantitativo para
determinar la actividad antimicrobiana en
plásticos. El análisis de los resultados mostró
que ambos métodos aportan información
complementaria. Mientras el método de
difusión en agar resultó ser más sencillo que la
adaptación de la norma ASTM, este último
permitió calcular la reducción del crecimiento
de los microorganismos sensibles. A partir de
los resultados evaluados concluimos que el
método de difusión (cualitativo) podría ser
utilizado para la evaluación rápida (y a bajo
costo) de múltiples películas (empleado
usualmente para la determinación de la CIM);
mientras que el método de recuento
(cuantitativo) permitiría cuantificar el efecto
antimicrobiano específico, siendo más
apropiado para la evaluación de efectividad de
polímeros aditivados con agentes biocidas.
Asimismo, destacamos la participación del INTI
en el desarrollo de técnicas cuyo objetivo
principal es dar respaldo científico-tecnológico
a las innovaciones industriales de la región.
REFERENCIAS
1. Blanco Massani, y col. (2008) Food addit contam 25,
1424–1430
2. ATMS E2149-10 ASTM International standard (2010).
3. ISO/TS 19036
4. Hammer y col (2001). Palaeontologia Electronica 4 9.
5. Green y col (2011). Biointerphases 6 13.
6. Cowan y col (2003) J Ind Microbiol Biotechnol 30 10.