DESARROLLO DE PELÍCULAS DE CELULOSA MICROFIBRILADA CON
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA PARA LA INDUSTRIA ALIMENTARIA
Molina, V.(i); Blanco Massani, M.(i)*; de Titto, G. (i,ii); Corbalán, N.(iii); Vincent, P. (iii);
Pomares, F.(iii); Eisenberg, P.(i,ii)
(i) INTI-Plásticos. (ii) Instituto de Investigación en Ingeniería Ambiental (3iA), UNSaM. (iii)
INSIBIO-CONICET. *blanco@inti.gob.ar.

OBJETIVO
La tecnología de materiales activos
antimicrobianos permite extender la vida útil y/o
mejorar la calidad higiénico-sanitaria de los
alimentos. Una potencial aplicación de
películas de celulosa microfibrilada (CMF)
aparece en el campo de los materiales para
envases activos. Entre los agentes
antimicrobianos que puede contener un
material activo, los péptidos antimicrobianos
constituyen una prometedora alternativa.
Microcina J25(G12Y) (MccJ25(G12Y)) es un
péptido que presenta actividad antimicrobiana
frente a bacterias enteropatogénicas. Este
péptido puede ser degradado por enzimas
digestivas por lo tanto no interferiría con la flora
microbiana natural al ser consumido. El objetivo
de este trabajo fue incorporar MccJ25(G12Y)
en CMF para producir materiales con actividad
antimicrobiana.
DESCRIPCIÓN
Obtención de Películas de CMF. Una
suspensión de -celulosa (Sigma C8002) al 1%
(m/v) en agua destilada se procesó en un
Microfluidizador M-110P (Microfluidics Corp) a
1500 bar para producir la microfibrilación de las
fibras. La suspensión obtenida se dejó
evaporar lentamente a 40ºC para obtener
películas de gramaje aprox. 80 mg/cm2. Se
evaluó la superficie de las películas obtenidas
utilizando Microscopía Electrónica de Barrido
(FE-SEM) utilizando para ello un microscopio
FEI Quanta 250 FEG.
Microorganismos y condiciones de cultivo.
E. coli SBG231(pG12Y) (bacteria productora de
MccJ25 (G12Y)) y E. coli AB1133 (sensible a
microcina) fueron cultivadas a 37ºC en medio
de cultivo mínimo M9 (Sigma Aldrich)
suplementado con MgSO4 (1 mg/ml), vitamina
B1 (1 mg/ml) y glucosa (0,2 % (m/v)). Hasta su
uso, las cepas se mantuvieron a -20ºC en 15%
(v/v) de glicerol.
Producción y purificación de MccJ25(G12Y).
El sobrenadante libre de células de un cultivo
overnight de E. coli SBG231(pG12Y) fue
sembrado en un cartucho preparativo C8. La
columna se lavó con agua y concentraciones
crecientes de metanol (20-100% (v/v)). La
fracción activa (eluída con metanol al 100%
(v/v)) se concentró y purificó por HPLC
(columna semipreparativa de fase reversa C18,
Waters μBondapack 10 μm de 300 x 19 mm)
eluyendo con un gradiente de concentración
lineal de acetonitrilo disuelto en agua entre el
20 y 100 % (v/v), en presencia de TFA al 0,1 %
(v/v). La microcina eluída se detectó a 275 nm
y su actividad antimicrobiana se evaluó frente a
E. coli AB1133. La fracción activa colectada se
liofilizó (Liofilizador Telstar Lioalea-6 (-50º C) y
se almacenó a temperatura ambiente hasta su
uso.
Activación de la CMF. a) Determinación del
tiempo mínimo de activación. Un fragmento de
película de CMF (0,35 cm2) se contactó (5, 15,
30, 60 y 120 minutos a 30ºC) con 0,2 ml de
solución de MccJ25(G12Y) correspondiente a
la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) de
este péptido en solución acuosa (ver (b)) [1].
b) Determinación de la CIM de MccJ25(G12Y).
Diferentes concentraciones del péptido
antimicrobiano (6,25 10-3 a 8 10-1 mg/ml) se
contactaron con la película durante 5 minutos.
Luego de los tratamientos de activación
descriptos en (a) y (b), las películas se lavaron
con agua destilada estéril y se determinó su
actividad antimicrobiana como se detalla a
continuación. Todos los ensayos de activación
de la película se llevaron a cabo en dos
experimentos independientes, por triplicado.
Evaluación de la actividad antimicrobiana
de MccJ25(G12Y) en la película de CMF. La
película tratada con MccJ25(G12Y) se colocó
en placas preparadas con medio M9 semisólido
suplementado, inoculadas con E. coli AB1133
(107 UFC/ml) [2]. Luego de incubar (18 h, 35
ºC), la actividad antimicrobiana de las películas
se puso en evidencia por la aparición de halos
de inhibición que fueron medidos con el
programa ImageJ 47t. (Wayne Rasband.
National Institutes of Health, USA) y
expresados como áreas de inhibición relativa
(áreas de inhibición/área de las películas).
Análisis estadístico. Los datos
experimentales fueron sujetos a un análisis de
varianza (ANOVA) y se aplicó el test de Tukey
con un nivel de significancia del 95%. Se utilizó
el programa Minitab Statistic release 12
(Pennsylvania, USA).
RESULTADOS
En la Figura 1a se muestra la -celulosa antes
del proceso de microfibrilación donde se
observa una amplia distribución de tamaño de

partícula con la estructura de fibra conservada.
La estructura microfibrilar se aprecia en la
Figura 1b, donde se encuentran fibras de
diámetros menores que 10 m dispuestas de
manera entrelazada debido a su alta relación
de aspecto (largo/diámetro) en la película de
CMF.

Figura 1. Micrografías SEM: a) -celulosa; b) de una
película de CMF.
En la Tabla 1 se muestran las áreas de
inhibición relativas de la película de CMF luego
de ser tratada con MccJ25(G12Y) (1,25 10-2
mg/ml) durante diferentes tiempos. No se
observaron diferencias significativas (P ≥ 0,05)
en el área de inhibición relativa de las películas
para los tiempos estudiados. Estos resultados
sugieren una rápida sorción de microcina en la
película (a partir de 5 minutos de contacto)
(Tabla 1). La sorción de péptidos para la
obtención de películas activas ha sido
informada para diferentes materiales. En el
caso de la activación de una película de celofán
con nisina se requirieron 12 horas de contacto
[3], esto remarca el corto tiempo de contacto
necesario para obtener una película de CMF
activa. La rápida adsorción de MccJ25(G12Y)
en la película de CMF indicaría una alto grado
de afinidad de este péptido por la celulosa.
Tabla 1. Actividad antimicrobiana de la película de CMF
luego del contacto (30ºC) con MccJ25(G12Y) durante
diferentes tiempos.
Tiempo de contacto
(min)
Área de inhibición relativa
(a,b)
5 2,9 (0,3) a
15 3,0 (0,5) a
30 3,5 (0,6) a
60 3,3 (0,5) a
120 3,1(0,3) a
(a) –Valores seguidos de letras iguales en una misma
columna no presentan diferencias significativas (P< 0.05)
(b) –Los datos entre paréntesis corresponden a la
desviación standard de los replicados.
Para la obtención de películas activas
antimicrobianas por sorción, es importante
determinar la concentración mínima de
compuesto antimicrobiano a partir de la cual
ocurre la activación de la película. Como se
muestra en la Figura 2, la película de CMF
tratada con MccJ25(G12Y) en una
concentración de 6.25 10-3 mg/ml, no presentó
actividad inhibitoria, mientras que a partir de
1.25 10-2 mg/ml se obtuvo una película activa,
siendo esta última concentración definida como
la inhibitoria mínima (CIM) para lograr la
activación. La CIM encontrada para la
activación de la película de CMF en nuestro
trabajo, se encuentra en el orden de la
reportada para MccJ25 (G12Y) en solución
acuosa [1], indicando que el proceso de
activación y/o la matriz celulósica no ejercen
influencias negativas en la actividad
antimicrobiana del péptido. Asimismo, para las
concentraciones estudiadas no se obtuvo
saturación de la película con el péptido (Fig 2).

Figura 2. Actividad antimicrobiana de la película de MFC
luego del contacto con distintas concentraciones de
MccJ25 (G12Y).
Luego del proceso de activación, la película de
CMF tratada fue lavada con agua destilada
estéril a los fines de descontaminarla para
evaluar su efecto inhibitorio. La película
conservó su actividad antimicrobiana aún luego
de dicho lavado, indicando que existirían
fuertes interacciones entre el péptido
antimicrobiano y la matriz de CMF.
CONCLUSIONES
Para las posibles aplicaciones tecnológicas
resulta importante destacar que a partir de una
concentración de solución de contacto de 1.25
10-2 mg/ml de MccJ25(G12Y) y un tiempo de
contacto de 5 minutos, puede obtenerse una
película de celulosa microfibrilada con actividad
antimicrobiana. Las interacciones entre el
péptido antimicrobiano y la matriz de CMF
podrían deberse a la capacidad de los grupos
hidroxilo de la celulosa para formar puente
hidrogeno [4], y las propiedades anfifílicas de
MccJ25 (G12Y) [5] que posibilitarían
interacciones polares de tipo dipolo-dipolo y/o
enlaces hidrógeno con la celulosa,
favoreciendo la sorción y brindando estabilidad
a la actividad de la película.
En conjunto, estos resultados resultan
promisorios para el uso de CMF como soporte
para microcina J25(G12Y) en vistas de la
obtención de películas activas contra bacterias
enteropatogénicas para ser usadas en la
industria de alimentos.
REFERENCIAS
1. Pomares, y col. (2009) Appl environ microbiol, 75,
5734–5738
2. Blanco Massani, y col. (2008) Food addit contam 25,
1424–1430
3. Guerra y col (2005) Lett Appl Microbiol, 40, 106-110
4. Lavoine y col. (2012) Carbohydrate Polym 90, 735– 764
(2012)
5. Rosengren, y col (2003) JACS, 125, 12464-12474

a) b)