ESTUDIO DEL EFECTO SINÉRGICO DE BACTERIOCINAS
DE BACTERIAS LACTICAS COMBINADAS CON
COMPUESTOS ANTIMICROBIANOS FRENTE A Listeria.

Verdi1, MC; Castellano2, P.; Vignolo2, G.; Eisenberg1,3, P.; Blanco Massani1, M.
1INTI Plásticos; 2CERELA-CONICET; 33iA-UNSAM.
mverdi@inti.gob.ar


Introducción

A diferencia de muchas bacterias, Listeria
puede crecer y multiplicarse en algunos
alimentos refrigerados, causando severos
brotes de infección alimentaria. En estudios
previos de nuestro grupo de trabajo, se
evaluaron combinaciones de nisina (Nis) con
sorbato de potasio (SP), propionato de calcio
(PC) y lactato de sodio (LS) mostrando efectos
inhibitorios sinérgicos frente a Listeria innocua
7 [1].
Las bacteriocinas de bacterias lácticas tienen
potencial como conservantes naturales de
alimentos. Lactobacillus curvatus CRL705,
cepa aislada de un producto cárnico
fermentado [2], produce la bacteriocina
conocida como “lactocina AL705” (AL705) con
actividad antilisteria [3].

Objetivo

Con el fin de reducir la cantidad de compuestos
antimicrobianos utilizados para inhibir Listeria,
el presente trabajo tuvo como objetivo estudiar
el efecto de la adición de AL705 a las
combinaciones previamente evaluadas y
además, determinar los efectos inhibitorios
(bacteriostáticos o bactericidas) de mezclas
ternarias.

Descripción

Microorganismos y condiciones de cultivo.
Listeria innocua 7 (cedida por CERELA-
CONICET) fue cultivada (18-24h) a 35°C en
medio Mueller Hinton (MH). Lactobacillus
curvatus CRL1579, bacteria derivada de L.
curvatus CRL705 y capaz de producir lactocina
AL705, fue cultivada en MRS a 30°C [4]. Hasta
su uso las cepas fueron mantenidas a -20°C en
15% de glicerol.

Agentes antimicrobianos. Lactocina AL705
fue obtenida a partir del crecimiento de
Lactobacillus curvatus CRL1579 y posterior
precipitación con sulfato de amonio según lo
informado por Blanco Massani y col. 2013 [5].
Se prepararon soluciones madre de AL705,
nisina (Maxinis®, Argentina), sorbato de
potasio (Inmobal Nutrer, Argentina), propionato
de calcio (Inmobal Nutrer, Argentina) y lactato
de sodio (Sigma, EEUU) en buffer fosfato
estéril (KH2PO4-Na2HPO4 0,067M, pH 5,4) en
las concentraciones apropiadas para cada
experimento.

Combinaciones ternarias. Para evaluar las
interacciones originadas al agregar AL705 a las
combinaciones de Nis+SP, Nis+PC y Nis+LS,
se construyeron gráficos tridimensionales,
donde cada eje representó la concentración
inhibitoria mínima (CIM) del antimicrobiano. De
esta manera los gráficos presentaron dos ejes
fijos (CIM AL705 y CIM Nis) y un eje variable
compuesto por la CIM de X (X= SP, PC o LS).
Se calculó el plano conformado por la CIM de
cada compuesto (plano aditivo) y luego se
evaluaron tres puntos para cada combinación
por el método de difusión en agar, (i) un punto
aditivo sobre el plano mencionado; (ii) un punto
por debajo de este indicando interacción
sinérgica; (iii) un punto por encima indicando
antagonismo. Para evitar informar falsos
positivos, en todas las composiciones ternarias
las concentraciones de cada antimicrobiano
evaluadas fueron menores a la CIM individual.

Efecto inhibitorio. Para determinar el modo de
acción (bacteriostático o bactericida) de las
combinaciones antimicrobianas, un inóculo
conocido de L. innocua 7 (106 UFC/ml) se
incubó en medio Muller Hinton (MH) líquido (pH
5,4, 35°C, 24h) en contacto con las soluciones
antimicrobianas. Se tomó el recuento inicial y
final del microorganismo sensible y la densidad
óptica (turbidez). Se utilizó como control
negativo de inhibición un tubo conteniendo
buffer en lugar de las mezclas.

Resultados

Combinaciones ternarias. Los resultados
mostraron que la adición de lactocina AL705 a
las combinaciones de Nis+X redujo las
cantidades de antimicrobianos necesarias para
inhibir el crecimiento de L. innocua 7 a
concentraciones subinhibitorias. Los puntos

que representan las mezclas antimicrobianas
estuvieron por debajo del plano aditivo, lo que
sugiere un efecto sinérgico (Fig. 1a, b y c).
La interacción entre Nis y SP, PC o LS frente a
L. innocua ha sido previamente determinada
mostrando actividad inhibitoria sinérgica. En el
presente trabajo, la presencia de lactocina
AL705 aumentó el efecto sinérgico que ya se
había observado.
La adición de AL705 a Nis+X permitió
reducciones del 61,6% (AL705), 97,5% (Nis),
90% (LS), 90% (PC) y 91,7% (SP).



Figura 1: Gráficos tridimensionales obtenidos a partir de
las combinaciones de antimicrobianos estudiadas. El plano
aditivo se encuentra conformado por la CIM Nis vs CIM
AL705 vs CIM X (con X= SP, PC, LS).

Efecto inhibitorio. La Tabla 1 muestra los
recuentos bacterianos y la turbidez obtenidos
después de 24h de incubación. Para dos de las
mezclas ternarias (Nis+PC+AL705 y
Nis+LS+AL705), la turbidez permaneció igual,
mientras que para la tercera (Nis+SP+AL705),
se vio un muy pequeño aumento respecto al
tiempo cero. En contraste, el tratamiento
control mostró un notable aumento de la
turbidez luego de la incubación. Esto, junto con
la reducción del número de células viables en
comparación con el control, indicó un efecto
bactericida para todas las combinaciones
ternarias estudiadas.

Tabla 1: Recuento (Log UFC/ml) y turbidez luego de la
incubación (24h, 35°C) para las combinaciones ternarias
con AL705 y el control.

Trata-
miento
Turbidez
(530nm)
Log
UFC/ml
Turbidez
(530nm)
Log
UFC/ml
0hs 24hs
Control 0,01 ± 0,01 6,89 ± 0,96 0,50 ± 0,13
8,73 ±
0,31
Nis+SP+
AL705 0,01 ± 0,01 NE 0,05 ± 0,01 ND
Nis+PC+
AL705 0,01 ± 0,01 NE 0,01 ± 0,01 ND
Nis+LS+
AL705 0,00 ± 0,01 NE 0,01 ± 0,01 ND
NE: no evaluado; ND: no detectado

Conclusiones

En conclusión, los resultados presentados en
este trabajo demostraron que AL705
combinado con nisina, sorbato de potasio,
propionato de calcio o lactato sódico presentan
un efecto sinérgico y bactericida contra L.
innocua 7. Estos resultados son prometedores
para el diseño de estrategias para satisfacer las
demandas de los consumidores por alimentos
más seguros y saludables.

Bibliografía

[1] Verdi MC (2016). Efectos sinérgicos de nisina, sorbato
de potasio, propionato de calcio y lactato de sodio frente a
Listeria innocua y Staphylococcus aureus. XIV Congreso
Argentino de Microbiología 2016.
[2] Vignolo G (1993). Antibacterial activity of Lactobacillus
strains isolated from dry fermented sausages. J Appl
Bacteriol, 75, 344-349.
[3] Hebert E (2012). Genome Sequence of the Bacteriocin-
Producing Lactobacillus curvatus Strain CRL705. J
Bacteriol, 194, 538-539.
[4] Castellano P (2006). Inhibition of Listeria innocua and
Brochothrix thermosphacta in vacuum-packaged meat by
addition of bacteriocinogenic Lactobacillus curvatus
CRL705 and its bacteriocins. Letters in Applied
Microbiology, 43(2), 194–199.
[5] Blanco Massani M (2013). Adsorption of the bacteriocins
produced by Lactobacillus curvatus CRL705 on a
multilayer-LLDPE film for food-packaging applications.
LWT-Food Science and Technology, 53(1), 128–138.